Ventilator-geassocieerde pneumonie (VAP) op de Intensive Care (ICU)

INVOERING

Ventilator-geassocieerde pneumonie (VAP) verwijst doorgaans naar nosocomiale pneumonie die zich 48 uur later ontwikkelt door endotracheale intubatie en mechanische beademing. IC-patiënten die mechanische beademing krijgen, hebben een 4 keer hoger risico op het ontwikkelen van pneumonie met een percentage van 3% per dag na dag 7 in de intensive care. Er zijn verschillende risicofactoren gemeld die verband houden met VAP, waaronder de duur van mechanische beademing, de aanwezigheid van chronische longziekte, sepsis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), neurologische ziekte en trauma. Het immuunsysteem verdedigt de gastheer tegen infectie. Beschermende immuniteit kan worden onderverdeeld in aangeboren en adaptieve immuniteit. De aangeboren immuunrespons ontwikkelt zich als een eerste verdedigingsbarrière in de gastheer en zet een onmiddellijke, maar niet-specifieke immuunrespons op om de indringers snel te vernietigen of te beperken. De aangeboren afweermechanismen zijn het uitwendige epitheel, de slijmvliesoppervlakken, de cellen (NK-cellen, fagocyten) en het complementsysteem.

Adaptieve immuniteit is een tweedelijnsverdediging die T (cellulaire) en B (humorale) celgemedieerde reacties omvat. Dit is specifiek, richt zich alleen op ziekteverwekkers en niet op zichzelf, en heeft een geheugen om een ​​langdurige immuniteit tegen herinfectie in stand te houden. Hoewel het aangeboren immuunsysteem de verfijnde specificiteit van adaptieve immuniteit mist, kan het zelf van niet-zelf onderscheiden. Aangeboren immuunherkenning wordt gemedieerd door een systeem van kiembaan-gecodeerde receptoren genaamd patroonherkenningsreceptoren (PRR's) die geconserveerde moleculaire patronen (pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen, PAMP's) herkennen die geassocieerd zijn met microbiële pathogenen. Deze receptoren zijn gekoppeld aan signaaltransductieroutes die de expressie van een verscheidenheid aan induceerbare immuunresponsgenen regelen.

TLR's regelen zowel aangeboren als adaptieve immuunresponsen. De door TLR geïnduceerde ontstekingsreactie is afhankelijk van een gemeenschappelijke signaalroute die wordt gemedieerd door het adaptermolecuul MyD88. TLR-expressie wordt waargenomen in een verscheidenheid aan cellen zoals macrofagen, neutrofielen, dendritische cellen, epitheelcellen afgeleid van darm, long en derma, B- en T-lymfocyten. TLR4 was de eerste zoogdier-TLR die werd geïdentificeerd en is betrokken bij de herkenning van lipopolysaccharide (LPS), een belangrijke celwandcomponent van gramnegatieve bacteriën die sepsis kan veroorzaken. TLR2 is de krachtigste receptor en herkent een breed scala aan PAMP's van bacteriën, gisten, schimmels, parasieten en virussen. TLR9 herkent niet-gemethyleerde CpG-motieven die aanwezig zijn in bacterieel DNA.

Het sepsissyndroom wordt vaak gecompliceerd door de ontwikkeling van ziekenhuisinfecties, met name gramnegatieve pneumonie. Bevindingen geven aan dat TLR9 dient als een belangrijk signaal bij het genereren van beschermende aangeboren reacties op bacteriële pathogenen van de long en dat is vereist voor effectieve aangeboren immuunresponsen tegen Gram-negatieve bacteriële pathogenen. Niet-gemethyleerde CpG-motieven komen veel voor in genomisch DNA van bacteriën, maar niet in gewervelden. De herkenning van CpG-motieven activeert afweermechanismen van de gastheer, wat leidt tot aangeboren en verworven immuunresponsen. Cellen die TLR-9 tot expressie brengen zijn de plasmacytoïde dendritische cellen (PDC's) en de B-cellen en produceren als gevolg hiervan Th1-achtige pro-inflammatoire cytokines, interferonen en chemokines. Activering van TLR-9 induceert de productie van a) cytokinen (IL-12, IL-1, IL-6, IL-8), interferon (IFN)-γ en tumornecrosefactor (TNF-)α die Th1 pro-inflammatoire cytokines zijn en b) IL-10 en IL-4, die Th2 pro-inflammatoire cytokinen zijn die immunosuppressie induceren.

Th1-cytokines spelen een centrale rol bij ontsteking en activering van macrofagen, NK-cellen en neutrofielen. Th2-cytokinen remmen de Th1-immuunrespons. Dit veroorzaakt een systemisch systemisch inflammatoir responssyndroom. Ook spelen tolachtige receptoren-2 (TLR2) en -4 (TLR4) een cruciale rol bij chronische obstructieve longziekte (COPD). Hun activering door LPS van Gram (-) en Gram (+) bacteriën leidt tot activering van neutrofielen, NK-cellen, T-, B-cellen en inflammatoire cytokines. Bij chronische ziekten houdt ontregelde ontsteking deze systemen in een staat van constante activering, mogelijk resulterend in weefselbeschadiging en progressieve ziekte. Het begrijpen van het TLR-systeem zou van onschatbare waarde moeten zijn om de immuunresponsen van de gastheer te manipuleren.

DOELEN

1. De rol van CD4+ και CD8+ Τ-lymfocyten in de pathogenese van VAP onderzoeken en toelichten. Ook het niveau van cytokines IL-4 en IFN-γ, het tijdstip waarop de patiënten op de IC VAP ontwikkelen en de veranderingen in de subpopulaties van Τ-lymfocyten.
2. Om apoptose van macrofagen en hun vermogen tot fagocyteren bij VAP-patiënten te evalueren.
3. De expressie en mogelijke polymorfismen van TLR-2-, TLR-4- en TLR-9-genen bestuderen.

Inzicht in de immuunrespons op VAP zal de voorbereiding van immunotherapieprotocollen mogelijk maken om de immunologische respons te reguleren.

METHODEN

MATERIALEN EN METHODES

Bronchoalveolaire lavage verwerking

Op de eerste dag worden bij elke patiënt bloedmonsters, bronchoalveolaire lavage (BAL) en tracheobronchiale aspiraat (TBA) afgenomen. Bronchoscopie is een techniek om de binnenkant van de luchtwegen te visualiseren voor diagnostische en therapeutische doeleinden. Een bronchoscoop wordt in de luchtwegen ingebracht, meestal via de neus of mond, of af en toe via een tracheostoma. Hierdoor kan de arts de luchtwegen van de patiënt onderzoeken op afwijkingen zoals vreemde voorwerpen, bloedingen, tumoren of ontstekingen. Monsters kunnen uit de longen worden genomen: biopsieën, vloeistof (bronchoalveolaire lavage) of endobronchiaal borstelen. BAL wordt meestal uitgevoerd om longziekte te diagnosticeren. BAL wordt met name vaak gebruikt om infecties te diagnosticeren bij mensen met problemen met het immuunsysteem, longontsteking bij mensen aan beademingsapparatuur en sommige soorten longkanker. BAL wordt vaak gebruikt in immunologisch onderzoek als middel om cellen of pathogeenniveaus in de longen (T-celpopulaties) te bemonsteren. Monsters kunnen binnen 48 uur na de diagnose van VAP opnieuw worden genomen. BAL wordt in 10% FBS-RPMIc geplaatst en gecentrifugeerd bij 400 g, 5 min, en vervolgens wordt RPMI-1640 en 10% FBS toegevoegd. Het aantal en het type cellen zal worden bepaald door Μay-Grunwald-Giemsa-kleuring en de subpopulaties met flowcytometrie.

PBMC-isolatie

Menselijke lymfocyten kunnen het gemakkelijkst uit perifeer bloed worden geïsoleerd door dichtheidscentrifugatie met het koolhydraatpolymeer Ficoll (Ficoll Histopaque, Sigma, Cat 1077-1). Dit levert een populatie mononucleaire cellen op aan het grensvlak die is ontdaan van rode bloedcellen en de meeste polymorfonucleaire leukocyten of granulocyten. De resulterende populatie, mononucleaire cellen uit perifeer bloed genoemd, bestaat voornamelijk uit lymfocyten en monocyten. Verdund bloed met antistolling wordt over Ficoll aangebracht en gecentrifugeerd bij 400 g, 30 minuten bij 20 ºC (trage acceleratie, geen rem). Rode bloedcellen, polymorfonucleaire leukocyten of granulocyten hebben een hogere dichtheid van Ficoll en bevinden zich op de bodem van de buis. Maar mononucleaire cellen bestaande uit lymfocyten samen met enkele monocyten binden eroverheen en kunnen op het grensvlak worden teruggevonden. Cellen worden driemaal gewassen met 1xPBS met 1 mM EDTA om Ficoll en bloedplaatjes te verwijderen.

Labeling van antilichamen

Anti-CD3-FITC (fluoresceïne-isothiocyanaat), anti-CD8-PE (fycoerythrine), anti-CD4-PE, anti-IFN-γ en anti-IL-4, anti-CD4, anti-CD8 en controleert IgG-FITC en -PE zal worden gebruikt voor het labelen van cellen. Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), een reactief derivaat van fluoresceïne, is een van de meest voorkomende fluoroforen geweest die chemisch zijn gehecht aan andere, niet-fluorescerende moleculen om nieuwe fluorescerende moleculen te creëren voor een verscheidenheid aan toepassingen. Het DAKO-systeem zal worden gebruikt. Voor kleuring zal immunochemie worden gebruikt na het uitplaten van de cellen op Superfrost Plus-objectglaasjes door cytocentrifugatie met de kit van DAKO volgens de instructies van de fabrikant.

Immunohistochemie

Lymfocyten zullen worden gestimuleerd in platen met 24 putjes in RPMI-1640 bij 10% foetaal kalfsserum in aanwezigheid van forbol-12-myristaat-13-acetaat, 25 ng/ml; ionomycine; 1 µmol; en Brefeldin A, 10 µg/ml (Sigma-Aldrich; St, Louis, MO). Cytospins worden gemaakt met behulp van cytocentrifugatie van 150 µL van de gestimuleerde suspensie en worden bewaard bij -80°C. Op elk objectglaasje worden ongeveer 175.000 cellen cytogesponnen, waarvan voldoende lymfocyten zijn om te kleuren. De dubbele immunocytochemische methode voor de bepaling en meting van CD8+IFN-+, CD8+IFN-+ (of CD4+IFN-+, CD4+IFN-+) zal in twee stappen worden uitgevoerd. Gebruik bij stap één het primaire anti-CD8 (of anti-CD4, respectievelijk) muis-anti-menselijk monoklonaal antilichaam met secundair konijn-anti-muis IgG-FITC-antilichaam. Bij stap twee, na permeabilisatie, een primair anti-IFN- of IL-4 muis anti-humaan monoklonaal antilichaam (Caltag; Burlingame, CA) met secundair konijn anti-muis IgG-PE. Er wordt een permeabilisatiekit gebruikt volgens de instructies van de fabrikant (Dako). Voor de schatting van elke verhouding, 500 T-cellen tellen we > 10 cytospins indien nodig gekleurd omdat dit aantal voldoende is om een ​​gemiddelde waarde per proefpersoon te verkrijgen die constant blijft na verdere verhoging van het aantal getelde cellen.

Flowcytometrische analyse

De monsters die waren bereid zoals hierboven beschreven, werden geanalyseerd op een door fluorescentie geactiveerde cytometer (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, VK). De lymfocyten waren qua volume en complexiteit strak gepoort op een voorwaartse (0o) en zijwaartse lichtverstrooiing (90o) modus. Met fycocyanaat geconjugeerde anti-menselijke CD45 monoklonale antilichamen (DAKO; Ely, VK) zullen worden gebruikt als pan-leukocytenkleuring om niet-leukocytengebeurtenissen uit te sluiten door middel van logische poorten. Het percentage éénkleurige, tweekleurige en driekleurige positieve cellen zal worden gemeten en de gemiddelde kanaalwaarde evenals de relatieve fluorescentie-intensiteit (RFI) die overeenkomt met de antigeendichtheid wii worden geschat. QC-Combo Kit (FCSC; San Jun, Puerto Rico) zal worden gebruikt voor de kwantificering van antilichaambinding.

Statistische analyse

De normaliteit van de numerieke parameters zal worden getest met behulp van de Kolmogorov-Smirnov-test. De Wilcoxon-toets met ondertekende rang voor niet-parametrische uitkomsten en de gepaarde t-toets voor parametrische uitkomsten zullen worden gebruikt voor het vergelijken van gegevens op twee verschillende tijdstippen (bij stabiele toestand en bij exacerbatie). Statistische software (SPSS versie 11.0; SPSS; Chicago, IL) zal worden gebruikt voor analyse.