Ventilator-associerad lunginflammation (VAP) på intensivvårdsavdelning (ICU)

INTRODUKTION

Ventilatorassocierad pneumoni (VAP) hänvisar vanligtvis till nosokomial lunginflammation som utvecklas 48 timmar senare från endotrakeal intubation och mekanisk ventilation. ICU-patienter som får mekanisk ventilation har fyra gånger högre risk att utveckla lunginflammation med en frekvens på 3 % per dag efter dag 7 i intensivvårdsavdelningen. Flera riskfaktorer har rapporterats vara associerade med VAP, inklusive varaktigheten av mekanisk ventilation, förekomsten av kronisk lungsjukdom, sepsis, akut andnödsyndrom (ARDS), neurologisk sjukdom och trauma. Immunsystemet försvarar värden mot infektion. Skyddsimmunitet kan delas in i medfödd och adaptiv immunitet. Det medfödda immunsvaret utvecklas som en första försvarsbarriär i värden och sätter igång ett omedelbart, men ospecifikt, immunsvar för att snabbt förstöra eller begränsa inkräktarna. De medfödda försvarsmekanismerna är det yttre epitelet, slemhinneytorna, cellerna (NK-celler, fagocyter) och komplementsystemet.

Adaptiv immunitet är ett andra linjens försvar som inkluderar T (cellulära) och B (humorala) cellmedierade svar. Detta är specifikt, riktar sig endast mot patogener och inte sig själv, och har minne för att upprätthålla en långvarig immunitet mot återinfektion. Även om det medfödda immunsystemet saknar den fina specificiteten av adaptiv immunitet kan det skilja jag från icke-jag. Medfödd immunigenkänning förmedlas av ett system av könslinjekodade receptorer som kallas mönsterigenkänningsreceptorer (PRR) som känner igen konserverade molekylära mönster (patogenassocierade molekylära mönster, PAMPs) som är associerade med mikrobiella patogener. Dessa receptorer är kopplade till signaltransduktionsvägar som kontrollerar uttryck av en mängd olika inducerbara immunsvarsgener.

TLR kontrollerar både medfödda och adaptiva immunsvar. Det TLR-inducerade inflammatoriska svaret är beroende av en vanlig signalväg som förmedlas av adaptermolekylen MyD88. TLR-uttryck observeras i en mängd olika celler såsom makrofager, neutrofiler, dendritiska celler, epitelceller härrörande från tarm, lunga och derma, B- och T-lymfocyter. TLR4 var den första däggdjurs-TLR som identifierades och är involverad i igenkännandet av lipopolysackarider (LPS), en viktig cellväggskomponent av gramnegativa bakterier som kan inducera sepsis. TLR2 är den mest kraftfulla receptorn och känner igen en mängd olika PAMP från bakterier, jäst, svampar, parasiter och virus. TLR9 känner igen ometylerade CpG-motiv som finns i bakteriellt DNA.

Sepsissyndrom kompliceras ofta av utvecklingen av nosokomiala infektioner, särskilt gramnegativ lunginflammation. Fynden indikerar att TLR9 fungerar som en viktig signal i genereringen av skyddande medfödda svar på bakteriella patogener i lungan och som krävs för effektiva medfödda immunsvar mot gramnegativa bakteriella patogener. Ometylerade CpG-motiv är vanliga i bakteriellt men inte genomiskt DNA från ryggradsdjur. Igenkännandet av CpG-motiv aktiverar värdens försvarsmekanismer som leder till medfödda och förvärvade immunsvar. Celler som uttrycker TLR-9 är plasmacytoida dendritiska celler (PDC) och B-celler och som en konsekvens producerar Th1-liknande proinflammatoriska cytokiner, interferoner och kemokiner. Aktivering av TLR-9 inducerar produktionen av a) cytokiner (IL-12, IL-1, IL-6, IL-8), interferon (IFN)-y och tumörnekrosfaktor (TNF-)α som är Th1 proinflammatoriska cytokiner och b) IL-10 och IL-4 som är Th2-proinflammatoriska cytokiner som inducerar immunsuppression.

Th1-cytokiner spelar en central roll vid inflammation och aktivering av makrofager, NK-celler och neutrofiler. Th2-cytokiner hämmar Th1-immunsvaret. Detta orsakar ett systemiskt systemiskt inflammatoriskt svarssyndrom. Tullliknande receptorer-2 (TLR2) och -4 (TLR4) spelar också en avgörande roll vid kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL). Deras aktivering av LPS av Gram (-) och Gram (+) bakterier leder till aktivering av neutrofiler, NK-celler, T-, B-celler och inflammatoriska cytokiner. Vid kronisk sjukdom upprätthåller oreglerad inflammation dessa system i ett tillstånd av konstant aktivering, vilket potentiellt kan resultera i vävnadsskada och progressiv sjukdom. Att förstå TLR-systemet bör erbjuda ovärderliga möjligheter för att manipulera värdens immunsvar.

MÅL

1. För att undersöka och belysa rollen av CD4+ και CD8+ Τ-lymfocyter i patogenesen av VAP. Även nivån av cytokinerna IL-4 och IFN-y den tidpunkt då patienterna på ICU utvecklar VAP och förändringarna i subpopulationerna av Τ-lymfocyter.
2. För att utvärdera apoptos av makrofager och deras förmåga att fagocytera hos VAP-patienter.
3. Att studera uttrycket och möjliga polymorfismer av TLR-2-, TLR-4- och TLR-9-gener.

Förståelse av immunsvar mot VAP kommer att möjliggöra framställning av immunterapiprotokoll för att reglera immunologiskt svar.

METODER

MATERIAL OCH METODER

Bronkoalveolär sköljning

Den första dagen kommer prover av blod, bronkoalveolär sköljning (BAL) och trakeobronkial aspirat (TBA) tas från varje patient. Bronkoskopi är en teknik för att visualisera insidan av luftvägarna för diagnostiska och terapeutiska ändamål. Ett bronkoskop sätts in i luftvägarna, vanligtvis genom näsan eller munnen, eller ibland genom en trakeostomi. Detta gör att läkaren kan undersöka patientens luftvägar för avvikelser såsom främmande kroppar, blödningar, tumörer eller inflammation. Prover kan tas inifrån lungorna: biopsier, vätska (bronkoalveolär sköljning) eller endobronkial borstning. BAL utförs vanligtvis för att diagnostisera lungsjukdom. I synnerhet används BAL ofta för att diagnostisera infektioner hos personer med problem med immunsystemet, lunginflammation hos personer på ventilatorer och vissa typer av lungcancer. BAL används ofta inom immunologisk forskning som ett sätt att ta prover på celler eller patogennivåer i lungan (T-cellspopulationer). Prover kan tas igen inom 48 timmar från diagnosen VAP. BAL kommer att placeras i 10 % FBS-RPMIc och centrifugeras vid 400 g, 5 min, och sedan tillsätts RPMI-1640 och 10 % FBS. Antalet och typen av celler kommer att definieras av Μay-Grunwald-Giemsa-färgning och subpopulationerna med flödescytometri.

PBMC-isolering

Humana lymfocyter kan enklast isoleras från perifert blod genom densitetscentrifugering med kolhydratpolymeren Ficoll (Ficoll Histopaque, Sigma, Cat 1077-1). Detta ger en population av mononukleära celler vid gränsytan som har utarmats på röda blodkroppar och de flesta polymorfonukleära leukocyter eller granulocyter. Den resulterande populationen, som kallas mononukleära celler i perifert blod, består huvudsakligen av lymfocyter och monocyter. Utspätt antikoagulerat blod läggs över Ficoll och centrifugeras vid 400 g, 30 minuter vid 20 ºC (långsam acceleration, ingen broms). Röda blodkroppar, polymorfonukleära leukocyter eller granulocyter har högre densitet från Ficoll och är till botten av röret. Men mononukleära celler som består av lymfocyter tillsammans med några monocyter band över det och kan återvinnas vid gränsytan. Celler tvättas med 1xPBS med 1 mM EDTA 3 gånger för att avlägsna Ficoll och blodplättar.

Antikroppsmärkning

Anti-CD3-FITC (fluoresceinisotiocyanat), anti-CD8-PE (fykoerytrin), anti-CD4-PE, anti-IFN-γ och anti-IL-4, anti-CD4, anti-CD8 och kontrollerar IgG-FITC och -PE kommer att användas för att märka celler. Fluoresceinisotiocyanat (FITC), ett reaktivt derivat av fluorescein, har varit en av de vanligaste fluoroforerna kemiskt fästa till andra, icke-fluorescerande molekyler för att skapa nya fluorescerande molekyler för en mängd olika tillämpningar. DAKO-system kommer att användas. För färgning kommer immunkemi att användas efter utplätering av cellerna på Superfrost Plus-objektglas genom cytocentrifugering med satsen DAKO enligt tillverkarens instruktioner.

Immunhistokemi

Lymfocyter kommer att stimuleras i plattor med 24 brunnar i RPMI-1640 med 10 % fetalt kalvserum i närvaro av forbol 12-myristat 13-acetat, 25 ng/ml; jonomycin; 1 umol; och Brefeldin A, 10 pg/ml (Sigma-Aldrich; St, Louis, MO). Cytospins kommer att göras med hjälp av cytocentrifugering av 150 µL av den stimulerade suspensionen och förvaras vid -80°C. Ungefär 175 000 celler kommer att cytospunnas på varje objektglas av vilka är tillräckligt med lymfocyter för att färga. Den dubbla immuncytokemiska metoden för bestämning och mätning av CD8+IFN-+, CD8+IFN-+ (eller CD4+IFN-+, CD4+IFN-+) kommer att utföras i två steg. I steg ett, använd den primära anti-CD8 (eller anti-CD4, respektive) mus anti-human monoklonal antikropp med sekundär kanin anti-mus IgG-FITC antikropp. Vid steg två, efter permeabilisering, en primär anti-IFN- eller IL-4 mus anti-human monoklonal antikropp (Caltag; Burlingame, CA) med sekundär kanin anti-mus IgG-PE. En permeabiliseringskit kommer att användas enligt tillverkarens (Dako) instruktioner. För uppskattning av varje förhållande, 500 T-celler räknar vi > 10 cytospin färgade om nödvändigt eftersom detta antal är tillräckligt för att erhålla ett medelvärde per individ som förblir konstant efter att ytterligare öka antalet räknade celler.

Flödescytometrisk analys

Proverna framställda enligt beskrivningen ovan analyserades på en fluorescensaktiverad cytometer (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, UK). Lymfocyterna var tätt gated av volym och komplexitet på ett framåt (0o) och sidoljusspridning (90o) läge. Phycocyanat-konjugerade anti-humana CD45 monoklonala antikroppar (DAKO; Ely, Storbritannien) kommer att användas som pan-leukocytfärgning för att utesluta icke-leukocythändelser genom logisk gating. Procentandelen av enfärgade, tvåfärgade och trefärgade positiva celler kommer att mätas och medelkanalvärdet såväl som den relativa fluorescensintensiteten (RFI) som motsvarar antigendensiteten beräknas. QC-Combo Kit (FCSC; San Jun, Puerto Rico) kommer att användas för kvantifiering av antikroppsbindning.

Statistisk analys

Normaliteten hos de numeriska parametrarna kommer att testas med Kolmogorov-Smirnov-testet. Wilcoxon signed-rank test för icke-parametriska utfall och parat t-test för parametriska utfall kommer att användas för jämförelse av data vid två olika tidpunkter (vid stabilt tillstånd och vid exacerbation). Statistisk programvara (SPSS version 11.0; SPSS; Chicago, IL) kommer att användas för analys.