Pneumonie sous ventilation assistée (PAV) en unité de soins intensifs (USI)

INTRODUCTION

La pneumonie sous ventilation assistée (PAV) fait généralement référence à une pneumonie nosocomiale se développant 48 heures plus tard à la suite d'une intubation endotrachéale et d'une ventilation mécanique. l'unité de soins intensifs. Plusieurs facteurs de risque ont été signalés comme étant associés à la PAV, notamment la durée de la ventilation mécanique, la présence d'une maladie pulmonaire chronique, d'une septicémie, d'un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), d'une maladie neurologique et d'un traumatisme. Le système immunitaire défend l'hôte contre l'infection. L'immunité protectrice peut être divisée en immunité innée et adaptative. La réponse immunitaire innée évolue comme une première barrière de défense chez l'hôte et monte une réponse immunitaire immédiate, mais non spécifique, pour détruire ou limiter rapidement les envahisseurs. Les mécanismes de défense innés sont les épithéliums externes, les surfaces muqueuses, les cellules (cellules NK, phagocytes) et le système du complément.

L'immunité adaptative est une défense de deuxième ligne qui comprend les réponses médiées par les cellules T (cellulaires) et B (humorales). Ceci est spécifique, ne cible que les agents pathogènes et non soi-même, et a la mémoire pour maintenir une immunité durable contre la réinfection. Bien que le système immunitaire inné n'ait pas la spécificité fine de l'immunité adaptative, il peut distinguer le soi du non-soi. La reconnaissance immunitaire innée est médiée par un système de récepteurs codés par la lignée germinale appelés récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) qui reconnaissent les modèles moléculaires conservés (modèles moléculaires associés aux pathogènes, PAMP) associés aux agents pathogènes microbiens. Ces récepteurs sont couplés à des voies de transduction du signal qui contrôlent l'expression d'une variété de gènes de réponse immunitaire inductibles.

Les TLR contrôlent à la fois les réponses immunitaires innées et adaptatives. La réponse inflammatoire induite par le TLR dépend d'une voie de signalisation commune médiée par la molécule adaptatrice MyD88. L'expression de TLR est observée dans une variété de cellules telles que les macrophages, les neutrophiles, les cellules dendritiques, les cellules épithéliales dérivées de l'intestin, du poumon et du derme, les lymphocytes B et T.TLR4 a été le premier TLR de mammifère identifié et est impliqué dans la reconnaissance du lipopolysaccharide (LPS), un composant majeur de la paroi cellulaire des bactéries Gram-négatives qui peut induire une septicémie. TLR2 est le récepteur le plus puissant et reconnaît une grande variété de PAMP provenant de bactéries, levures, champignons, parasites et virus. TLR9 reconnaît les motifs CpG non méthylés présents dans l'ADN bactérien.

Le syndrome septique est fréquemment compliqué par le développement d'infections nosocomiales, en particulier de pneumonies à Gram négatif. Les résultats indiquent que TLR9 sert de signal important dans la génération de réponses innées protectrices aux pathogènes bactériens du poumon et qui est nécessaire pour des réponses immunitaires innées efficaces contre les pathogènes bactériens à Gram négatif. Les motifs CpG non méthylés sont répandus dans l'ADN génomique bactérien mais pas vertébré. La reconnaissance des motifs CpG active les mécanismes de défense de l'hôte conduisant à des réponses immunitaires innées et acquises. Les cellules qui expriment TLR-9 sont les cellules dendritiques plasmacytoïdes (PDC) et les cellules B et produisent par conséquent des cytokines pro-inflammatoires de type Th1, des interférons et des chimiokines. L'activation du TLR-9 induit la production de a) cytokines (IL-12, IL-1, IL-6, IL-8), d'interféron (IFN)-γ et de facteur de nécrose tumorale (TNF-)α qui sont des cytokines pro-inflammatoires Th1 et b) IL-10 et IL-4 qui sont des cytokines pro-inflammatoires Th2 qui induisent une immunosuppression.

Les cytokines Th1 jouent un rôle central dans l'inflammation et l'activation des macrophages, des cellules NK et des neutrophiles. Les cytokines Th2 inhibent la réponse immunitaire Th1. Cela provoque un syndrome de réponse inflammatoire systémique systémique. En outre, les récepteurs de type péage-2 (TLR2) et -4 (TLR4) jouent un rôle crucial dans la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Leur activation par le LPS des bactéries Gram (-) et Gram (+) conduit à l'activation des neutrophiles, des cellules NK, des cellules T, B et des cytokines inflammatoires. Dans les maladies chroniques, l'inflammation dérégulée maintient ces systèmes dans un état d'activation constante, entraînant potentiellement des lésions tissulaires et une maladie évolutive. Comprendre le système TLR devrait offrir une opportunité inestimable pour manipuler les réponses immunitaires de l'hôte.

OBJECTIFS

1. Étudier et élucider le rôle des lymphocytes CD4+ και CD8+ Τ dans la pathogenèse de la PAV. En outre, le niveau de cytokines IL-4 et IFN-γ, le moment où les patients en soins intensifs développent une VAP et les modifications des sous-populations de lymphocytes Τ.
2. Évaluer l'apoptose des macrophages et leur capacité à phagocyter les patients atteints de PAV.
3. Étudier l'expression et les éventuels polymorphismes des gènes TLR-2, TLR-4 et TLR-9.

La compréhension de la réponse immunitaire à la PAV permettra la préparation de protocoles d'immunothérapie afin de réguler la réponse immunologique.

MÉTHODES

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Traitement du lavage bronchoalvéolaire

Au premier jour, chez chaque patient des échantillons de sang, un lavage bronchoalvéolaire (BAL) et une aspiration trachéobronchique (TBA) seront prélevés. La bronchoscopie est une technique de visualisation de l'intérieur des voies respiratoires à des fins diagnostiques et thérapeutiques. Un bronchoscope est inséré dans les voies respiratoires, généralement par le nez ou la bouche, ou parfois par une trachéotomie. Cela permet au praticien d'examiner les voies respiratoires du patient à la recherche d'anomalies telles que des corps étrangers, des saignements, des tumeurs ou une inflammation. Des échantillons peuvent être prélevés à l'intérieur des poumons : biopsies, liquide (lavage bronchoalvéolaire) ou brossage endobronchique. Le BAL est généralement effectué pour diagnostiquer une maladie pulmonaire. En particulier, le BAL est couramment utilisé pour diagnostiquer les infections chez les personnes ayant des problèmes de système immunitaire, la pneumonie chez les personnes sous ventilateurs et certains types de cancer du poumon. Le BAL est souvent utilisé dans la recherche immunologique comme moyen d'échantillonner des cellules ou des niveaux d'agents pathogènes dans les poumons (populations de lymphocytes T). Les prélèvements peuvent être repris dans les 48 heures suivant le diagnostic de PAV. Le BAL sera placé dans du FBS-RPMIc à 10 % et des centrifugeuses à 400 g, 5 min, puis sera ajouté du RPMI-1640 et du FBS à 10 %. Le nombre et le type des cellules seront définis par coloration May-Grunwald-Giemsa, et les sous-populations par cytométrie en flux.

Isolation des PBMC

Les lymphocytes humains peuvent être isolés le plus facilement du sang périphérique par centrifugation de densité avec le polymère glucidique Ficoll (Ficoll Histopaque, Sigma, Cat 1077-1). Cela donne une population de cellules mononucléaires à l'interface qui a été appauvrie en globules rouges et en la plupart des leucocytes ou granulocytes polymorphonucléaires. La population résultante, appelée cellules mononucléaires du sang périphérique, est principalement constituée de lymphocytes et de monocytes. Le sang anticoagulé dilué est déposé sur du Ficoll et centrifuge à 400g, 30min à 20ºC (accélération lente, pas de frein). Les globules rouges, les leucocytes polymorphonucléaires ou les granulocytes ont une densité plus élevée à partir de Ficoll et se trouvent au fond du tube. Mais les cellules mononucléaires constituées de lymphocytes et de quelques monocytes se regroupent dessus et peuvent être récupérées à l'interface. Les cellules sont lavées en utilisant 1 x PBS avec 1 mM d'EDTA 3 fois pour éliminer le Ficoll et les plaquettes.

Marquage des anticorps

Anti-CD3-FITC (isothiocyanate de fluorescéine), anti-CD8-PE (phycoérythrine), anti-CD4-PE, anti-IFN-γ et anti-IL-4, anti-CD4, anti-CD8 et contrôles IgG-FITC et -PE sera utilisé pour le marquage des cellules. L'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), un dérivé réactif de la fluorescéine, a été l'un des fluorophores les plus courants chimiquement attachés à d'autres molécules non fluorescentes pour créer de nouvelles molécules fluorescentes pour une variété d'applications. Le système DAKO sera utilisé. Pour la coloration, l'immunochimie sera utilisée après étalement des cellules sur des lames Superfrost Plus par cytocentrifugation avec le kit de DAKO selon les instructions du fabricant.

Immunohistochimie

Les lymphocytes seront stimulés dans des plaques de 24 puits dans du RPMI-1640 à 10 % de sérum de veau fœtal en présence de phorbol 12-myristate 13 acétate, 25 ng/mL ; ionomycine; 1 µmole; et Brefeldin A, 10 µg/mL (Sigma-Aldrich; St, Louis, MO). Les cytocentrifugations seront réalisées par cytocentrifugation de 150 µL de la suspension stimulée et conservées à - 80°C. Environ 175 000 cellules seront cytofilées sur chaque lame dont il y aura suffisamment de lymphocytes à colorer. La double méthode immunocytochimique pour le dosage et la mesure de CD8+IFN-+, CD8+IFN-+ (ou CD4+IFN-+, CD4+IFN-+) sera réalisée en deux étapes. À la première étape, utilisez l'anticorps monoclonal anti-humain de souris primaire anti-CD8 (ou anti-CD4, respectivement) avec un anticorps secondaire de lapin anti-souris IgG-FITC. À la deuxième étape, après perméabilisation, un anticorps monoclonal anti-humain de souris anti-IFN ou IL-4 primaire (Caltag; Burlingame, CA) avec IgG-PE anti-souris de lapin secondaire. Un kit de perméabilisation sera utilisé selon les instructions du fabricant (Dako). Pour l'estimation de chaque ratio, 500 lymphocytes T on compte > 10 cytospins colorés si nécessaire car ce nombre est suffisant pour obtenir une valeur moyenne par sujet qui reste constante après avoir encore augmenté le nombre de cellules comptées.

Analyse cytométrique en flux

Les échantillons préparés comme décrit ci-dessus ont été analysés sur un cytomètre activé par fluorescence (EPICS ELITE ; Coultronics ; Louton, UK). Les lymphocytes ont été étroitement contrôlés par volume et complexité sur un mode de diffusion de lumière avant (0o) et latéral (90o). Des anticorps monoclonaux anti-CD45 humains conjugués au phycocyanate (DAKO ; Ely, Royaume-Uni) seront utilisés comme coloration pan-leucocytaire pour exclure les événements non leucocytaires par déclenchement logique. Le pourcentage de cellules positives unicolores, bicolores et tricolores sera mesuré et la valeur moyenne du canal ainsi que l'intensité de fluorescence relative (RFI) correspondant à la densité d'antigène seront estimées. Le kit QC-Combo (FCSC ; San Jun, Porto Rico) sera utilisé pour la quantification de la liaison des anticorps.

Analyses statistiques

La normalité des paramètres numériques sera testée à l'aide du test de Kolmogorov-Smirnov. Le test de rang signé de Wilcoxon pour les résultats non paramétriques et le test t apparié pour les résultats paramétriques seront utilisés pour comparer les données à deux moments différents (à un état stable et à une exacerbation). Un logiciel statistique (SPSS version 11.0 ; SPSS ; Chicago, IL) sera utilisé pour l'analyse.