Neumonía asociada al ventilador (NAV) en la unidad de cuidados intensivos (UCI)

INTRODUCCIÓN

La neumonía asociada al ventilador (NAV) generalmente se refiere a la neumonía nosocomial que se desarrolla 48 horas después de la intubación endotraqueal y la ventilación mecánica. Los pacientes de la UCI que reciben ventilación mecánica tienen un riesgo 4 veces mayor de desarrollar neumonía con una tasa del 3 % por día después del día 7 en la unidad de cuidados intensivos. Se ha informado que varios factores de riesgo están asociados con VAP, incluida la duración de la ventilación mecánica, la presencia de enfermedad pulmonar crónica, sepsis, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), enfermedad neurológica y trauma. El sistema inmunológico defiende al huésped contra la infección. La inmunidad protectora se puede dividir en inmunidad innata y adaptativa. La respuesta inmunitaria innata evoluciona como una primera barrera de defensa en el huésped y monta una respuesta inmunitaria inmediata, pero no específica, para destruir o limitar rápidamente a los invasores. Los mecanismos de defensa innatos son los epitelios externos, las superficies mucosas, las células (células NK, fagocitos) y el sistema del complemento.

La inmunidad adaptativa es una defensa de segunda línea que incluye respuestas mediadas por células T (celulares) y B (humorales). Esto es específico, se dirige solo a los patógenos y no a sí mismo, y tiene memoria para mantener una inmunidad duradera contra la reinfección. Aunque el sistema inmunitario innato carece de la fina especificidad de la inmunidad adaptativa, puede distinguir lo propio de lo ajeno. El reconocimiento inmunitario innato está mediado por un sistema de receptores codificados en la línea germinal denominados receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que reconocen patrones moleculares conservados (patrones moleculares asociados a patógenos, PAMP) que están asociados con patógenos microbianos. Estos receptores están acoplados a vías de transducción de señales que controlan la expresión de una variedad de genes de respuesta inmunitaria inducibles.

Los TLR controlan las respuestas inmunitarias tanto innatas como adaptativas. La respuesta inflamatoria inducida por TLR depende de una vía de señalización común que está mediada por la molécula adaptadora MyD88. La expresión de TLR se observa en una variedad de células como macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, células epiteliales derivadas del intestino, pulmón y derma, linfocitos B y T. TLR4 fue el primer TLR de mamífero identificado y está involucrado en el reconocimiento de lipopolisacárido (LPS), un componente principal de la pared celular de las bacterias Gram-negativas que pueden inducir sepsis. TLR2 es el receptor más potente y reconoce una amplia variedad de PAMP de bacterias, levaduras, hongos, parásitos y virus. TLR9 reconoce motivos CpG no metilados presentes en el ADN bacteriano.

El síndrome de sepsis se complica con frecuencia por el desarrollo de infecciones nosocomiales, en particular neumonía por gramnegativos. Los hallazgos indican que TLR9 sirve como una señal importante en la generación de respuestas innatas protectoras a los patógenos bacterianos del pulmón y que se requiere para respuestas inmunitarias innatas efectivas contra los patógenos bacterianos Gram-negativos. Los motivos CpG no metilados prevalecen en el ADN genómico bacteriano pero no en el de vertebrados. El reconocimiento de motivos CpG activa los mecanismos de defensa del huésped que conducen a respuestas inmunitarias innatas y adquiridas. Las células que expresan TLR-9 son las células dendríticas plasmocitoides (PDC) y las células B y, como consecuencia, producen citocinas proinflamatorias similares a Th1, interferones y quimiocinas. La activación de TLR-9 induce la producción de a) citoquinas (IL-12, IL-1, IL-6, IL-8), interferón (IFN)-γ y factor de necrosis tumoral (TNF-)α que son citoquinas proinflamatorias Th1 yb) IL-10 e IL-4 que son citoquinas proinflamatorias Th2 que inducen inmunosupresión.

Las citoquinas Th1 juegan un papel central en la inflamación y activación de macrófagos, células NK y neutrófilos. Las citoquinas Th2 inhiben la respuesta inmune Th1. Esto provoca un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica sistémica. Además, los receptores tipo toll-2 (TLR2) y -4 (TLR4) juegan un papel crucial en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Su activación por LPS de bacterias Gram (-) y Gram (+) conduce a la activación de neutrófilos, células NK, células T, células B y citoquinas inflamatorias. En las enfermedades crónicas, la inflamación desregulada mantiene estos sistemas en un estado de activación constante, lo que puede resultar en daño tisular y enfermedad progresiva. Comprender el sistema TLR debería ofrecer una oportunidad invaluable para manipular las respuestas inmunes del huésped.

OBJETIVOS

1. Investigar y dilucidar el papel de los linfocitos CD4+ και CD8+ Τ en la patogenia de la VAP. Además, el nivel de citocinas IL-4 e IFN-γ el tiempo en que los pacientes en UCI desarrollan VAP y los cambios en las subpoblaciones de linfocitos Τ.
2. Evaluar la apoptosis de macrófagos y su capacidad fagocitaria en pacientes con NAVM.
3. Estudiar la expresión y posibles polimorfismos de los genes TLR-2, TLR-4 y TLR-9.

La comprensión de la respuesta inmune a la VAP permitirá la preparación de protocolos de inmunoterapia para regular la respuesta inmunológica.

MÉTODOS

MATERIALES Y MÉTODOS

Procesamiento de lavado broncoalveolar

El primer día, en cada paciente se tomarán muestras de sangre, lavado broncoalveolar (BAL) y aspirado traqueobronquial (TBA). La broncoscopia es una técnica de visualización del interior de las vías respiratorias con fines diagnósticos y terapéuticos. Se inserta un broncoscopio en las vías respiratorias, generalmente a través de la nariz o la boca, u ocasionalmente a través de una traqueotomía. Esto le permite al médico examinar las vías respiratorias del paciente en busca de anomalías como cuerpos extraños, sangrado, tumores o inflamación. Se pueden tomar muestras del interior de los pulmones: biopsias, líquido (lavado broncoalveolar) o cepillado endobronquial. El BAL generalmente se realiza para diagnosticar enfermedades pulmonares. En particular, el BAL se usa comúnmente para diagnosticar infecciones en personas con problemas del sistema inmunitario, neumonía en personas con ventiladores y algunos tipos de cáncer de pulmón. El BAL se usa a menudo en la investigación inmunológica como un medio para tomar muestras de células o niveles de patógenos en el pulmón (poblaciones de células T). Las muestras pueden tomarse nuevamente en 48 horas desde el diagnóstico de VAP. El BAL se colocará en 10 % FBS-RPMIc y se centrifugará a 400 g, 5 min, y luego se agregará RPMI-1640 y 10 % FBS. El número y el tipo de células se definirán por tinción de May-Grunwald-Giemsa, y las subpoblaciones por citometría de flujo.

aislamiento de PBMC

Los linfocitos humanos se pueden aislar más fácilmente de la sangre periférica mediante centrifugación de densidad con el polímero carbohidrato Ficoll (Ficoll Histopaque, Sigma, Cat 1077-1). Esto produce una población de células mononucleares en la interfase que ha perdido los glóbulos rojos y la mayoría de los leucocitos o granulocitos polimorfonucleares. La población resultante, denominada células mononucleares de sangre periférica, consiste principalmente en linfocitos y monocitos. La sangre anticoagulada diluida se coloca en capas sobre Ficoll y se centrifuga a 400 g, 30 min a 20 ºC (aceleración lenta, sin freno). Los glóbulos rojos, los leucocitos polimorfonucleares o los granulocitos tienen mayor densidad a partir de Ficoll y se encuentran al fondo del tubo. Pero las células mononucleares que consisten en linfocitos junto con algunos monocitos se unen sobre él y pueden recuperarse en la interfaz. Las células se lavan usando 1xPBS con EDTA 1 mM 3 veces para eliminar el Ficoll y las plaquetas.

Etiquetado de anticuerpos

Anti-CD3-FITC (isotiocianato de fluoresceína), anti-CD8-PE (ficoeritrina), anti-CD4-PE, anti-IFN-γ y anti-IL-4, anti-CD4, anti-CD8 y controles IgG-FITC y -PE se utilizará para el etiquetado de células. El isotiocianato de fluoresceína (FITC), un derivado reactivo de la fluoresceína, ha sido uno de los fluoróforos más comunes unidos químicamente a otras moléculas no fluorescentes para crear nuevas moléculas fluorescentes para una variedad de aplicaciones. Se utilizará el sistema DAKO. Para la tinción, se utilizará inmunoquímica después de sembrar las células en portaobjetos Superfrost Plus mediante citocentrifugación con el kit de DAKO según las instrucciones del fabricante.

inmunohistoquímica

Se estimularán los linfocitos en placas de 24 pocillos en RPMI-1640 con suero de ternera fetal al 10 % en presencia de acetato de forbol 12-miristato 13, 25 ng/ml; ionomicina; 1 µmol; y Brefeldin A, 10 µg/mL (Sigma-Aldrich; St, Louis, MO). Los citospines se realizarán mediante citocentrifugación de 150 µL de la suspensión estimulada y se almacenarán a -80 °C. Se citocentrifugarán aproximadamente 175.000 células en cada portaobjetos, de las cuales habrá suficientes linfocitos para teñir. El método inmunocitoquímico doble para la determinación y medición de CD8+IFN-+, CD8+IFN-+ (o CD4+IFN-+, CD4+IFN-+) se realizará en dos pasos. En el paso uno, utilice el anticuerpo monoclonal anti-humano de ratón anti-CD8 (o anti-CD4, respectivamente) primario con el anticuerpo IgG-FITC anti-ratón de conejo secundario. En el paso dos, después de la permeabilización, un anticuerpo monoclonal anti-humano de ratón anti-IFN- o IL-4 primario (Caltag; Burlingame, CA) con IgG-PE anti-ratón de conejo secundario. Se utilizará un kit de permeabilización de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Dako). Para la estimación de cada relación, 500 células T contamos > 10 citospines teñidos si es necesario porque este número es suficiente para obtener un valor medio por sujeto que permanece constante después de aumentar aún más el número de células contadas.

Análisis de citometría de flujo

Las muestras preparadas como se describe anteriormente se analizaron en un citómetro activado por fluorescencia (EPICS ELITE; Coultronics; Louton, Reino Unido). Los linfocitos se seleccionaron estrechamente por volumen y complejidad en un modo de dispersión de luz frontal (0o) y lateral (90o). Los anticuerpos monoclonales anti-CD45 humanos conjugados con ficocianato (DAKO; Ely, Reino Unido) se utilizarán como tinción pan-leucocitaria para excluir eventos no leucocitarios mediante selección lógica. Se medirá el porcentaje de células positivas de un color, dos colores y tres colores y se estimará el valor medio del canal, así como la intensidad de fluorescencia relativa (RFI) correspondiente a la densidad del antígeno. Se utilizará el kit QC-Combo (FCSC; San Jun, Puerto Rico) para la cuantificación de la unión de anticuerpos.

Análisis estadístico

La normalidad de los parámetros numéricos se probará mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. La prueba de rango con signo de Wilcoxon para resultados no paramétricos y la prueba t pareada para resultados paramétricos se utilizarán para comparar los datos en dos momentos diferentes (en condiciones estables y en exacerbaciones). Se utilizará software estadístico (SPSS versión 11.0; SPSS; Chicago, IL) para el análisis.