乾癬患者の微生物に対する標的療法の影響

はじめに 乾癬における炎症カスケードを制御する特に主要な役割として TNF-α、TH-17、および IL-17 が多数の研究で特定されているため、TNF-α および TH-17 アンタゴニストを含む標的療法は、乾癬の治療における大きなブレークスルーを表しています。 . TNF-α がウイルス感染に対する免疫応答において重要な役割を果たしていることはよく知られています。これは、ウイルス複製の直接的な阻害、ウイルス感染細胞の死滅、TNF/さらに、TNF-α アンタゴニストによる治療は、ウイルス接種ラットにおけるウイルス複製の増加、CD4+ および CD8+ T 細胞の進行性の喪失、および TNF-α のレベルの低下と関連していることが示されています。インターフェロン。 TNF-αアンタゴニストで治療された一部の患者では、一過性のT細胞応答性の低下も観察されました.10 TNF-α は特定の細胞型で CMV の産生を阻害することができ、CMV の主要な前初期プロモーターは TNF-α によって阻害されます。 CMV 感染中の TNF 産生の増加が報告されており、in vitro で抗 CMV 活性も示します。

TNF-α は、HPV 感染細胞のアポトーシスの誘導、HPV 感染ケラチノサイトの成長の停止、HPV 遺伝子転写のダウンレギュレーション、炎症反応の刺激、HLA クラスのアップレギュレーションによる HPV 感染の直接制御にも関与しています。抗原提示細胞のI成分。 HPV-16 の E6 タンパク質は、TNF 受容体 1 に直接結合し、宿主細胞の TNF 誘導アポトーシスを無効にすることが知られています。 最近の研究では、乾癬皮膚における HPV DNA の有病率が高く、乾癬患者における HPV5 抗体の増加が示されています。 乾癬の皮膚は特に HPV に対して寛容である可能性があるようです。 TNF-α拮抗薬を投与されている炎症性腸疾患の患者では、パップスメア異常の増加が観察されています。 ただし、HPV 保菌および HPV 関連疾患に対する抗 TNF 療法の具体的な効果は不明のままです。

エプスタイン-バーウイルス (EBV) は、特に免疫抑制治療を受けている患者において、いくつかの B 細胞および上皮細胞の悪性腫瘍に関連しています。 TNF-αアンタゴニストで治療された患者におけるリンパ増殖性疾患のリスクの増加が対処されています。 抗TNF-α薬の中止後に退縮したEBV関連リンパ増殖性疾患の症例報告も記載されていました。 したがって、抗TNF療法の免疫抑制によって少なくとも部分的に引き起こされるリスク増加の懸念が浮上し、EBVの連続的な再活性化を引き起こす可能性がありますが、まだ証明されていません.

TNF-αに対するモノクローナル抗体（インフリキシマブおよびアダリムマブ）および可溶性TNF受容体（エタネルセプト）を含む抗TNF-α薬は、日和見感染の危険因子として認識されています。 最近の研究では、エタネルセプトよりもアダリムマブを投与されている患者の日和見感染のリスクが高く、リスクの差は 10 倍から 17 倍であることが示されました。 しかし、抗 TNF 治療中の潜在的なウイルス再活性化に関する知識のほとんどは、炎症性腸疾患および関節リウマチ患者の研究から得られたものです。 さらに、これらの研究は主にヘルペスウイルスとウイルス性肝炎に焦点を当てています。 EBV、CMV、および HPV 感染が乾癬患者の TNF-α 拮抗薬による治療を複雑にしたいくつかの症例報告も報告されています。

IL-17 は、新たに同定された活性化 CD4+ T 細胞 (Th17 細胞)、γδT 細胞、CD8+ 細胞、および NKT 細胞のサブセットを含む、さまざまな細胞によって産生される炎症誘発性サイトカインです。 Klebsiella pneumonia、38 Bacteroides fragilis、Escherichia coli などの細胞外細菌感染に対する宿主防御における IL-17 の保護的役割を支持する証拠があります。 最近の研究では、IL-17 が一般的な真菌であるカンジダ アルビカンスに対するヒトの免疫に不可欠であることも示されました。

さまざまな細菌や真菌が乾癬の誘発および/または悪化に関連していると報告されています。 先行する扁桃腺化膿連鎖球菌感染による滴状乾癬の誘発についての最も強力な証拠が存在する。 Balciらはまた、健康な対照よりも乾癬患者の病変皮膚および鼻孔における黄色ブドウ球菌の定着率が有意に高いことも発見した. 彼らはまた、PASIスコアと、乾癬患者の病変皮膚における黄色ブドウ球菌培養および毒素産生の両方との間に有意な関係があることを示唆しました。

しかし、乾癬患者におけるTNF-α、TH-17、IL-17アンタゴニストおよびその他の標的薬剤の影響を調査する研究は限られています。

ねらい： 台湾におけるCMVの陽性率は学齢児で約50%、成人で90%以上。 EBV は、世界中の成人人口の 90% 以上で B リンパ球の持続感染を引き起こします.46 したがって、潜在的なウイルスや他の微生物に対する標的療法の影響を調査することの重要性は、いくら強調してもしすぎることはありません。 この研究の目的は、CMV、EBV、HPV を含むウイルスの活性化に対する TNF-α、TH-17、IL-17 アンタゴニストの投与の効果と、微生物の表面コロニー形成の蔓延に対する生物製剤の影響を前向きに調査することです。 、乾癬患者のHPV、細菌、真菌を含む。 トファシチニブ、セクキヌマブ、アプレミラストなどの新規標的薬剤の微生物効果も研究されます。

方法 患者の特徴と研究スケジュール 2011 年から 2011 年の間に台湾北部の第 3 次紹介センター (国立台湾大学病院 (NTUH)) で、乾癬のために TNF-α (エタネルセプトとアダリムマブ) を受ける予定で、現在服用している乾癬患者を含めます。 2015年。 また、臨床試験の使用または参加についてインフォームド コンセントに署名し、現在ウステキヌマブ、セクキヌマブ、トファシチニブ (CP690,550)、およびアプレミラストの標的療法を使用している患者も含まれます。 これらの臨床試験は、NTUH の研究倫理委員会によって承認されています (NTUH-REC: ウステキヌマブ、200806022M; セクキヌマブ、201104022MA; トファシチニブ、201012013MA; アプレミラスト、201010022M)。 患者自身またはその保護者は、この研究に参加する前に、これらの新薬の研究プロトコルについてインフォームド コンセントに署名しています。 私たちの研究またはその保護者のすべての参加者は、NTUH の研究倫理委員会 (NTUH-REC No: 201106079RC) によって承認された、この研究の別のインフォームド コンセントに署名する必要があります。

このプロジェクトは、2 つの関連する研究で構成されています。

研究1

1. 標的薬剤の投与を予定している患者：

   この前向き観察研究には、標的薬剤の投与を受ける予定の乾癬患者が含まれます。 登録後、CMV と EBV IgG がチェックされます。 患者は、生物製剤治療の開始前、標的治療の開始から 12 週間後および 24 週間後、標的治療の中止から 12 週間後に、血液、眉毛、および皮膚のうろこを採取します。 ウイルス負荷をチェックするために血液サンプルが送られ、リアルタイム PCR によって CMV および EBV ウイルス負荷が決定されます。 皮膚鱗屑の細菌、真菌培養および HPV DNA 検出も行われます。 HPVタイピングは遺伝子チップによって決定され、HPVウイルス量の半定量的測定が行われます。 乾癬の面積および重症度指数 (PASI) などの人口統計学的データおよび乾癬の活動パラメーターは、ベースラインおよび各研究訪問時に収集されます。 この研究の目的は、乾癬患者のCMV、EBV、HPV、細菌、真菌などの微生物に対する標的療法の投与の動的効果を調査することです。

   スタディ 2

2. 標的療法を受けた患者 プロジェクトの 2 番目の部分である症例対照研究には、3 か月以上標的薬剤を投与された乾癬患者が含まれます。 また、対照群として、標的薬剤または他の全身性抗乾癬薬で治療していない、年齢および疾患の重症度が一致する乾癬患者を募集します。 同様に、登録後、CMV と EBV IgG がチェックされます。 HPV 検出、皮膚鱗屑の細菌、真菌培養が行われました。 標的療法を用いて治療している乾癬患者とそうでない乾癬患者との間の潜伏ウイルス、ウイルス再活性化、細菌および真菌の皮膚コロニー形成の有病率の比較が行われる。

さらに、微生物検査は、標的療法の中止の 12 週間後に再度繰り返されます。 標的療法を中止した後のウイルス血清学、細菌および真菌培養データの動的変化が分析されます。

私たちの研究のこの部分の目的は、標的療法で治療された乾癬患者とそうでない乾癬患者の間の皮膚における潜在的なウイルスまたは微生物のコロニー形成の状態の違いを評価することでした.

HPV の非病変皮膚でのスケール サンプリング サンプリング領域は最初に Hibitane で洗浄され、表面の汚染を取り除くために粘着テープで優しくテープで留められます。 次に、乾癬のプラークから可能な限り離れて、頭と首の領域から表層の皮膚をこすり取り、目の細かいサンドペーパーを使用して角質層を研磨し、破片を収集して HPV 検出を行います。

皮膚ひだでの細菌および真菌の培養 ヒビタンでサンプリング領域をクリアした後、耳介後領域、鼠径部または腋窩領域を含む皮膚ひだから皮膚スワブのサンプルを採取します。皮膚の拭き取り。

HPV用の毛採取 被験者ごとに新しいピンセットで眉毛を抜きます。 無傷の毛包を含む毛のみが HPV 研究のために収集されます。

ウイルス負荷の決定

CMV および EBV ウイルス量の定量的 PCR 全血検体は、試験前に -80 ℃ で保存されました。 ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｉを用いて４００μＬのサンプルからＤＮＡを抽出した。 溶液の量は100μLでした。 次に、ウイルス学的診断のために研究室で実施された「社内」リアルタイム PCR アッセイを使用して、ウイルス DNA を増幅しました。 CMV については、前述のように、加水分解プローブ技術に基づくリアルタイム PCR アッセイが使用されました。 EBV については、以前に報告されたように、ハイブリダイゼーション プローブを使用した「社内」リアルタイム PCR アッセイが実施されました。 CMV 増幅は、ABI PRISM® 7500 (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France) で、次のサイクル パラメーターを使用して実行されました。 C および 60 ℃ で 1 分間 (ランプレート 0.8 ℃/秒上昇、1.6 ℃/秒下降、9600 エミュレーション モード)。 EBV アッセイは LightCycler® 1.5 (LC1.5; ロシュ・ダイアグノスティックス）。 EBV アッセイは、次のサイクル パラメーターで実行されました。 C、および 40 ℃ で 1 分間の冷却ステップ (昇温速度 20 ℃/秒)。 リアルタイム PCR アッセイは、最初のプロトコルからわずかに変更した後、LC480 で並行して実行されました。 1 × LightCycler® 480 プローブ マスター、200 nM フォワード プライマー、200 nM リバース プライマー、100 nM 加水分解プローブ、0.38 単位のウラシル-N-グリコシラーゼ (Invitrogen、Cergy-Pontoise、フランス) を含む 25 μL の混合物で、抽出した DNA 10 マイクロリットルを増幅しました。 ）。 EBV では、LC-Red 640 で標識されたハイブリダイゼーション プローブが FAM 標識加水分解プローブとして使用されました。 LC480 プロトコルで使用されるすべてのプライマーとプローブの配列を表 1に示します。 LC480 でのサイクル条件は次のとおりです。50 ℃で 2 分間、95 ℃で 10 分間、続いて 95 ℃で 15 秒間、60 ℃で 40 秒間、30 秒間の冷却ステップからなる 45 サイクル。 40 ℃ (ランプ レート 4.4 ℃/秒)。 CMV および EBV アッセイでは、感染細胞培養物から抽出され、プラスミドを使用して定量化されたウイルス DNA の 10 倍連続希釈から生成された標準曲線を使用して定量化が達成されました。 潜在的な PCR 阻害物質を検出するために、すべての DNA 抽出物を希釈せずに 1:10 に希釈してテストしました。 結果は対数で表した（ウイルスコピー数/mL）。 抽出希釈を考えると、感度閾値はすべてのアッセイで 1.4 ログでした。

HPV ジェノタイピングおよび半定量的 HPV ウイルス負荷 HPV 遺伝子チップ (Easychip HPV Genotyping Array、King Car、台北、台湾) は、HPV DNA の 39 のサブタイプ (6、11、16、18、26、31、 32, 33, 35, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 67, 68, 69, 70, 72, 74、82、CP8061、CP8304、L1AE5、MM4、MM7、および MM8) を単一の反応で、Huang らによって報告されています。 各標本の HPV の L1 領域のネストされたマルチプレックス PCR 産物は、遺伝子チップとハイブリダイズされます。 FAP59/64 および Fap6319R/6085F からなる皮膚型 HPV および DNA シーケンシング解析については、ネストされた PCR の他のセットも実行されます。 重複感染の存在を除外するために製品に対して実行されます。 遺伝子チップは複数の感染を検出することができ、皮膚向け PCR シーケンスは一度に 1 つの血清型の HPV しか検出できません。 ヒトゲノム DNA 抽出のための内部コントロール

1. . GAPDH、ギャップ-1/ギャップ-2 (ca. ~341 bp)
2. .ベータグロビン、KW42/KW29 (ca. ~510 bp)
3. .ベータグロビン、KC03/KC04 (ca. ~110 bp)
4. .ベータグロビン、KC03/KC05 (ca. ~150 bp)

粘膜HPV検出の戦略:

プライマー mDeAV1 5'-CGTCCM*ARRGGAWACTGATC-3' mDeAV2 5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3'-ビオチン5'-GCTCACTCAGTGTGGCAAAG-3'

皮膚型 HPV の検出には、ネストされた PCR プライマーの他のセットが次のように使用されます。

FAP59：5'-TAACWGTIGGICAYCCWTATT-3') FAP64：5'-CCWATATCWVHCATITCICCATC-3') FAP6085F：CCWGATCCHAATMRRTTGC FAP6319R：ACATTTGGGGGAAAAATTGTTTDGGRTCAA 検体中の HPV DNA 量を半定量法により測定した。 標本の相対光単位 (RLU) での発光信号強度を、標準的な陽性対照 (RLU/PC) と比較しました。