Vliv cílené terapie na mikroorganismy u pacientů s psoriázou

Úvod Vzhledem k tomu, že četné studie identifikovaly TNF-α, TH-17 a IL-17 jako zvláště hlavní role řídící zánětlivou kaskádu u psoriázy, cílené terapie, včetně antagonistů TNF-α a TH-17, představovaly hlavní průlom v léčbě psoriázy. . Je dobře známo, že TNF-α hraje důležitou roli v imunitní odpovědi na virové infekce, což je připisováno přímé inhibici replikace viru, zabíjení virově infikovaných buněk, indukci FasL-dependentních CD8+ T-lymfocytových efektorových drah prostřednictvím TNF/ Interakce TNF receptoru 2 a nepřímo podporují zánětlivou reakci. Kromě toho se ukázalo, že léčba antagonisty TNF-α je spojena se zvýšenou virovou replikací u krys naočkovaných virem, progresivní ztrátou CD4+ a CD8+ T buněk a sníženou hladinou TNF-α a interferon. U některých pacientů léčených antagonisty TNF-α byla také pozorována přechodná snížená schopnost reakce T buněk.10 TNF-a může inhibovat produkci CMV v určitých typech buněk a hlavní bezprostřední časný promotor CMV je inhibován TNF-a. Během infekce CMV byla hlášena zvýšená produkce TNF, která také vykazuje anti-CMV aktivitu in vitro.

TNF-α se také podílí na přímé kontrole infekce HPV indukcí apoptózy buněk infikovaných HPV, zastavením růstu keratinocytů infikovaných HPV a down-regulací transkripce genu HPV, stimulací zánětlivé reakce a up-regulací třídy HLA I složky v buňkách prezentujících antigen. Je známo, že E6 protein HPV-16 se přímo váže na TNF receptor 1 a ruší TNF-indukovanou apoptózu hostitelských buněk. Nedávné studie prokázaly vysokou prevalenci HPV DNA v psoriatické kůži a zvýšené protilátky proti HPV5 u pacientů s psoriázou. Zdá se, že psoriatická kůže může být specificky permisivní pro HPV. U pacientů se zánětlivými střevními onemocněními, kteří dostávali antagonisty TNF-a, byly pozorovány zvýšené abnormality v pap stěru. Specifické účinky anti-TNF terapie na přenos HPV a onemocnění související s HPV však zůstávají neznámé.

Virus Epstein-Barrové (EBV) je spojován s několika malignitami B-buněk a epiteliálních buněk, zejména u pacientů podstupujících imunosupresivní léčbu. Bylo řešeno zvýšené riziko lymfoproliferativních poruch u pacientů léčených antagonisty TNF-α. Byly také popsány kazuistiky lymfoproliferativních onemocnění spojených s EBV, které ustoupily po vysazení anti-TNF-α léků. Objevila se tedy obava ze zvýšeného rizika alespoň částečně způsobeného imunosupresí anti-TNF terapie, která může způsobit následnou reaktivaci EBV, ale zatím nebyla prokázána.

Anti-TNF-α léky, včetně monoklonálních protilátek proti TNF-α (infliximab a adalimumab) a solubilního TNF receptoru (etanercept), jsou uznávány jako rizikový faktor pro oportunní infekce. Nedávná studie prokázala vyšší riziko oportunních infekcí u pacientů užívajících adalimumab než etanercept, s 10 až 17násobným rozdílem v riziku. Většina poznatků o latentní virové reaktivaci během anti-TNF léčby však pochází ze studií pacientů se zánětlivým onemocněním střev a revmatoidní artritidou. Navíc se tyto studie zaměřují především na herpesviry a virové hepatitidy. Bylo také popsáno několik kazuistik, ve kterých infekce EBV, CMV a HPV komplikovaly terapii antagonisty TNF-α u pacientů s psoriázou.

IL-17 je prozánětlivý cytokin, který je produkován řadou buněk, včetně nově identifikované podskupiny aktivovaných CD4+ T buněk (buňky Th17), yδT buněk, CD8+ buněk a NKT buněk. Existují důkazy, které podporují ochrannou roli IL-17 v obraně hostitele proti extracelulárním bakteriálním infekcím, včetně Klebsiella pneumonia,38 Bacteroides fragilis a Escherichia coli. Nedávná studie také ukázala, že IL-17 je nezbytný pro lidskou imunitu proti běžné houbě Candida albicans.

Uvádí se, že různé bakterie a houby jsou spojeny s provokací a/nebo exacerbací psoriázy. Nejsilnější důkazy existují pro indukci guttální psoriázy předchozí tonzilární infekcí Streptococcus pyogenes. Balci et al také zjistili signifikantně vyšší míru kolonizace Staphylococcus aureus v kůži lézí a nosních dutin u pacientů s psoriázou než u zdravých kontrol. Naznačili také významný vztah mezi skóre PASI a kultivací S. aureus a produkcí toxinu v kůži lézí pacientů s psoriázou.

Studie zkoumající vliv antagonistů TNF-a, TH-17, IL-17 a dalších cílených látek u pacientů s psoriázou jsou však omezené.

Cíl: Na Tchaj-wanu je míra séropozitivnosti CMV přibližně 50 % u dětí školního věku a více než 90 % u dospělých. EBV způsobuje přetrvávající infekci B lymfocytů u více než 90 % dospělé populace na celém světě.46 Proto nelze přehnaně zdůrazňovat důležitost zkoumání vlivu cílových terapií na latentní viry a další mikroorganismy. Cílem této studie je prospektivně prozkoumat vliv podávání antagonistů TNF-α, TH-17 a IL-17 na aktivaci virů včetně CMV, EBV a HPV a vliv biologik na prevalenci povrchové kolonizace mikroorganismů včetně HPV, bakterií a hub u pacientů s psoriázou. Bude také studován mikrobiální účinek nových cílených látek, jako je tofacitinib, secukinumab a apremilast.

Metody Charakteristiky pacientů a harmonogram studie Zahrnujeme pacienty s psoriázou, kteří budou dostávat a kteří v současné době užívají TNF-α (etanercept a adalimumab) pro psoriázu, v terciárním referenčním centru na severním Tchaj-wanu (National Taiwan University Hospital (NTUH)) mezi lety 2011 a 2015. Zahrnujeme také pacienty, kteří podepsali informovaný souhlas s použitím nebo účastí v klinických studiích a v současné době používají cílové terapie ustekinumab, secukinumab, tofacitinib (CP690,550) a apremilast. Tyto klinické studie jsou schváleny Etickou komisí pro výzkum NTUH (NTUH-REC: ustekinumab, 200806022M; secukinumab, 201104022MA; tofacitinib, 201012013MA; apremilast, 201010022M). Sami pacienti nebo jejich opatrovníci podepsali informovaný souhlas s protokoly studie těchto nových léků před vstupem do této studie. Všichni účastníci naší studie nebo jejich opatrovníci také musí podepsat další informovaný souhlas s touto studií, který je schválen Etickým výborem pro výzkum NTUH (NTUH-REC No: 201106079RC).

Tento projekt se skládá ze dvou souvisejících studií:

Studium 1

1. Pacienti, u kterých je plánována léčba cílenými látkami:

   Tato prospektivní observační studie zahrnuje pacienty s psoriázou, kteří budou dostávat cílená léčiva. Po zařazení se kontroluje CMV a EBV IgG. Pacienti podstupují odběr krve, chloupků z obočí a kožních šupin před zahájením biologické léčby, 12 a 24 týdnů po zahájení cílové terapie, 12 týdnů po ukončení cílové terapie. Vzorky krve se zasílají ke kontrole virové nálože a virová nálož CMV a EBV se určuje pomocí PCR v reálném čase. Provádí se také bakteriální, plísňové kultury a detekce HPV DNA kožních šupin. Typizace HPV je určena genovým čipem a provádí se semikvantitativní měření virové nálože HPV. Demografické údaje a parametry aktivity psoriázy, jako je oblast psoriázy a index závažnosti (PASI), se shromažďují na začátku a při každé studijní návštěvě. Cílem této studie je prozkoumat dynamický účinek podávání cílových terapií na mikroorganismy, včetně CMV, EBV, HPV, bakterií a plísní u pacientů s psoriázou.

   Studium 2

2. Pacienti, kteří podstoupili cílenou léčbu Druhá část našeho projektu, případová a kontrolní studie, zahrnuje pacienty s psoriázou, kteří dostávali cílená léčiva déle než 3 měsíce. Jako kontrolní skupinu přijímáme také pacienty s psoriázou odpovídající věku a závažnosti onemocnění, kteří nejsou léčeni cílenými léky nebo jinými systémovými antipsoriatiky. Stejně tak se po zařazení kontroluje CMV a EBV IgG. Byla provedena detekce HPV, bakteriální a plísňové kultury kožních šupin. Je provedeno srovnání prevalence latentního viru, reaktivace viru, kolonizace kůže bakteriemi a houbami mezi pacienty s psoriázou, kteří jsou léčeni cílovou terapií a bez ní.

Vyšetření mikroorganismů se navíc znovu opakuje 12 týdnů po ukončení cílové terapie. Jsou analyzovány dynamické změny virové sérologie, bakteriálních a plísňových kultivačních dat po ukončení cílových terapií.

Cílem této části naší studie bylo posoudit jakýkoli rozdíl ve stavu kolonizace latentním virem nebo mikroorganismy v kůži mezi pacienty s psoriázou léčenými cílovou terapií a bez ní.

Odběr vzorků na kůži bez lézí pro HPV Oblasti odběru vzorků budou nejprve očištěny Hibitane a jemně přelepeny lepicími páskami, aby se odstranila povrchová kontaminace. Poté se odebere povrchový kožní seškrab z oblasti hlavy a krku, pokud možno co nejdále od jakýchkoli psoriatických plaků, pomocí jemného brusného papíru k obroušení stratum corneum a sběru trosek pro detekci HPV.

Kultivace bakterií a plísní na kožních záhybech Po vyčištění oblastí odběru pomocí Hibitane se vzorky kožních výtěrů odeberou z kožních záhybů, včetně retroaurikulárních oblastí, inguinálních nebo axilárních oblastí, pomocí sterilního vatového tamponu namočeného ve dvakrát destilované vodě a poté jemným stěr z kůže.

Vzorkování chloupků pro HPV Obočí se vytrhává pomocí nových pinzet používaných pro každý subjekt. Pro studie HPV se odebírají pouze vlasy obsahující neporušené vlasové folikuly.

Stanovení virové zátěže

Kvantitativní PCR pro virovou zátěž CMV a EBV Vzorky plné krve byly před testováním skladovány při -80 ◦C. DNA byla extrahována ze 400 μl vzorku pomocí MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation kit I za použití MagNA Pure Compact Instrument (Roche Diagnostics). Objem roztoku byl 100 ul. Virové DNA byly poté amplifikovány pomocí „interních“ testů PCR v reálném čase implementovaných v laboratoři pro virologickou diagnostiku. Pro CMV byly použity testy PCR v reálném čase založené na technologii hydrolyzační sondy, jak bylo popsáno dříve.48 Pro EBV byl proveden "interní" test PCR v reálném čase s použitím hybridizačních sond, jak bylo uvedeno dříve.49 CMV amplifikace byla provedena na ABI PRISM® 7500 (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Francie) s použitím následujících parametrů cyklu: 2 min při 50 ◦C a 10 min při 95 ◦C, následovaných 45 cykly, z nichž každý sestával z 15 s při 95 ◦ C a 1 min při 60 ◦C (rozsah 0,8 ◦C/s nahoru a 1,6 ◦C/s dolů; režim emulace 9600). EBV test byl proveden na LightCycler® 1.5 (LC1.5; Roche Diagnostics). Test EBV byl proveden s následujícími parametry cyklu: 1 min při 50 ◦C a 8 min při 95 ◦C, následuje 45 cyklů, z nichž každý se skládá z 10 s při 95 ◦C, 15 s při 58 ◦C a 15 s při 72 ◦ C a krok ochlazování 1 min při 40 ◦C (rychlost náběhu 20 ◦C/s). Testy PCR v reálném čase byly prováděny paralelně na LC480 po mírných úpravách z původních protokolů. Deset mikrolitrů extrahované DNA bylo amplifikováno ve 25 μl směsi obsahující 1 x LightCycler® 480 Probes Master, 200 nM přímý primer, 200 nM reverzní primer, 100 nM hydrolyzační sondu, 0,38 jednotek uracil-N-glykosylázy (Invitrogen, Cergy-Pontise ). Pro EBV byla hybridizační sonda značená LC-Red 640 použita jako hydrolyzační sonda značená FAM.49 Sekvence všech primerů a sond použitých v protokolech LC480 jsou uvedeny v tabulce 1. Podmínky cyklování na LC480 byly následující: 2 minuty při 50 ◦C a 10 minut při 95 ◦C, následovaných 45 cykly, z nichž každý sestával z 15 s při 95 ◦C a 40 s při 60 ◦C a krok chlazení 30 s při 40 ◦C (náběhová rychlost 4,4 ◦C/s). Pro testy CMV a EBV bylo kvantifikace dosaženo pomocí standardní křivky vytvořené z 10násobných sériových ředění virové DNA extrahované z infikovaných buněčných kultur a kvantifikované pomocí plazmidu. Pro detekci potenciálních inhibitorů PCR byly všechny DNA extrakty testovány neředěné a při ředění 1:10. Výsledky byly vyjádřeny logaritmicky (počet virových kopií/ml). Vzhledem k extrakčnímu ředění byl práh citlivosti 1,4 log pro všechny testy.

HPV genotypizace a semikvantitativní HPV virová zátěž HPV genový čip (Easychip HPV Genotyping Array, King Car, Taipei, Taiwan) nabídne revert-blot hybridizaci pro detekci 39 subtypů HPV DNA (6, 11, 16, 18, 26, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 67, 68, 69, 70, 70 74, 82, CP8061, CP8304, L1AE5, MM4, MM7 a MM8) v jediné reakci, jak uvádí Huang et al. Nested multiplex PCR produkty L1 oblasti HPV každého vzorku budou hybridizovány s genovým čipem. Druhá sada nested PCR bude také provedena pro HPV typu kůže, která se skládala z FAP59/64 a Fap6319R/6085F a analýzy sekvenování DNA. být proveden u produktu, aby se vyloučila přítomnost koinfekce. Genečip je schopen detekovat mnohočetné infekce a sekvenování PCR zaměřené na kůži dokáže detekovat pouze jeden sérotyp HPV v jeden okamžik. Interní kontrola pro extrakci lidské genomové DNA

1. . GAPDH, mezera-1/mezera-2 (ca. ~341 bp)
2. . Beta-globin, KW42/KW29 (cca. ~510 bp)
3. . Beta-globin, KC03/KC04 (cca. ~110 bp)
4. . Beta-globin, KC03/KC05 (cca. ~150 bp)

Strategie detekce slizničního HPV:

Základní nátěry mDeAV1 5'-CGTCCM*ARRGGAWACTGATC-3' mDeAV2 5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3'-Biotin GAP1: 5'-CCAACTTTCCCGCCTCTCAGC-3' GAP2: 5'-AAAACCGCCATGACT4:CCCAGGG5'CCCCATGTAG2TTGGG5'CCCTCTCAG2: CCCAGG5'CCCCATGACT2: KWGGG5'CCCTCTCAGC 5'-GCTCACTCAGTGTGGCAAAG-3'

Pro detekci kožního typu HPV budou použity další sady nested PCR primerů jako:

FAP59：5'-TAACWGTIGGICAYCCWTATT-3') FAP64：5'-CCWATATCWVHCATITCICCATC-3') FAP6085F：CCWGATCCHAATMRRTTGC FAP6319R：ACATTTGGGTDGGAAGRATTCiV metodou bylo stanoveno množství DNA HPitGGTDGGAAGRATTCAATT. Síla luminiscenčního signálu v relativních světelných jednotkách (RLU) vzorku byla porovnána se standardními pozitivními kontrolami (RLU/PC).