A célzott terápia hatása a mikroorganizmusokra pikkelysömörben szenvedő betegeknél

Bevezetés Mivel számos tanulmány azonosította a TNF-α-t, a TH-17-et és az IL-17-et a pikkelysömör gyulladásos kaszkádjában különösen fontos szerepként, a célterápiák, beleértve a TNF-α és TH-17 antagonistákat, jelentős áttörést jelentettek a pikkelysömör kezelésében. . Köztudott, hogy a TNF-α fontos szerepet játszik a vírusfertőzésekre adott immunválaszban, ami a vírusreplikáció közvetlen gátlásának, a vírussal fertőzött sejtek elpusztításának, a FasL-függő CD8+ T-limfocita effektor útvonalak indukciójának tulajdonítható a TNF/-en keresztül. A TNF-receptor 2 kölcsönhatása és közvetetten elősegíti a gyulladásos választ. Ezenkívül kimutatták, hogy a TNF-α antagonistákkal végzett kezelés fokozott vírusreplikációval jár vírussal beoltott patkányokban, a CD4+ és CD8+ T-sejtek progresszív elvesztésével, valamint a TNF-α és a interferon. Egyes TNF-α antagonistákkal kezelt betegeknél átmenetileg csökkent T-sejt-válaszkészséget is megfigyeltek. A TNF-α gátolja a CMV termelést bizonyos sejttípusokban, és a CMV fő azonnali korai promóterét gátolja a TNF-α. Fokozott TNF-termelésről számoltak be a CMV-fertőzés során, amely in vitro CMV-ellenes aktivitást is mutat.

A TNF-α a HPV-fertőzés közvetlen szabályozásában is részt vesz a HPV-vel fertőzött sejtek apoptózisának indukálásával, a HPV-vel fertőzött keratinociták növekedésének megállításával és a HPV-gén transzkripciójának leszabályozásával, a gyulladásos válasz stimulálásával és a HLA-osztály fokozásával. I komponensek antigénprezentáló sejtekben. Ismeretes, hogy a HPV-16 E6 fehérjéje közvetlenül kötődik a TNF-1 receptorhoz, és megszünteti a gazdasejtek TNF-indukálta apoptózisát. A közelmúltban végzett vizsgálatok kimutatták a HPV DNS magas előfordulását a pikkelysömörben szenvedő bőrben, és megnövekedett HPV5 antitesteket pikkelysömörben szenvedő betegeknél. Úgy tűnik, hogy a pszoriázisos bőr kifejezetten megengedő lehet a HPV számára. Gyulladásos bélbetegségben szenvedő betegeknél, akik TNF-α antagonistákat kaptak, fokozott pap-kenet eltéréseket figyeltek meg. Az anti-TNF-terápia HPV-hordozásra és HPV-vel összefüggő betegségekre gyakorolt ​​specifikus hatásai azonban továbbra sem ismertek.

Az Epstein-Barr vírus (EBV) számos B-sejtes és hámsejtes rosszindulatú daganattal jár, különösen az immunszuppresszív kezelés alatt álló betegeknél. A TNF-α antagonistákkal kezelt betegek limfoproliferatív rendellenességeinek fokozott kockázatával foglalkoztak. Az EBV-vel összefüggő limfoproliferatív betegségekről szóló esetjelentéseket is leírtak, amelyek az anti-TNF-α gyógyszerek visszavonása után visszafejlődnek. Így felmerült az aggodalom, hogy az anti-TNF terápia immunszuppressziója által legalább részben okozott megnövekedett kockázat, amely sima EBV reaktivációt okozhat, de még nem bizonyított.

Az anti-TNF-α gyógyszerek, köztük a TNF-α elleni monoklonális antitestek (infliximab és adalimumab) és az oldható TNF-receptor (etanercept) az opportunista fertőzések kockázati tényezőiként ismertek. Egy közelmúltban végzett tanulmány kimutatta, hogy az adalimumabot kapó betegeknél nagyobb az opportunista fertőzések kockázata, mint az etanerceptben, a kockázat 10-17-szeres különbségével. Az anti-TNF-kezelés során bekövetkező látens vírus-reaktivációra vonatkozó legtöbb tudás azonban gyulladásos bélbetegségben és rheumatoid arthritisben szenvedő betegeken végzett vizsgálatokból származik. Ezen túlmenően ezek a vizsgálatok elsősorban a herpeszvírusokra és a vírusos hepatitisre összpontosítanak. Számos olyan esetjelentést is beszámoltak, amelyekben az EBV, a CMV és a HPV fertőzés bonyolulttá tette a TNF-α antagonistákkal végzett kezelést pikkelysömörben szenvedő betegeknél.

Az IL-17 egy proinflammatorikus citokin, amelyet számos sejt termel, beleértve az aktivált CD4+ T-sejtek (Th17-sejtek), γδT-sejtek, CD8+-sejtek és NKT-sejtek újonnan azonosított alcsoportját. Bizonyítékok támasztják alá az IL-17 védő szerepét az extracelluláris bakteriális fertőzések elleni védekezésben, beleértve a Klebsiella tüdőgyulladást, a Bacteroides fragilis-t és az Escherichia colit. Egy nemrégiben készült tanulmány azt is kimutatta, hogy az IL-17 elengedhetetlen az emberi immunitáshoz a Candida albicans gomba ellen.

A jelentések szerint különféle baktériumok és gombák kapcsolódnak a pikkelysömör provokálásához és/vagy súlyosbodásához. A legerősebb bizonyíték arra vonatkozóan, hogy egy megelőző mandula Streptococcus pyogenes fertőzés okozta a guttate psoriasist. Balci és munkatársai szintén szignifikánsan magasabb Staphylococcus aureus kolonizációt találtak a pikkelysömörben szenvedő betegek bőrében és orrában, mint az egészséges kontrollokban. Szignifikáns összefüggést javasoltak a PASI-pontszámok és mind a S. aureus tenyésztése, mind a toxintermelés között a pikkelysömörben szenvedő betegek léziós bőrében.

A TNF-α, TH-17, IL-17 antagonisták és más célzott szerek pikkelysömörben szenvedő betegekre gyakorolt ​​hatását vizsgáló vizsgálatok azonban korlátozottak.

Cél: Tajvanon a CMV szeropozitív aránya körülbelül 50% az iskoláskorú gyermekeknél és több mint 90% a felnőtteknél. Az EBV a B-limfociták tartós fertőzését okozza a felnőtt lakosság több mint 90%-ában világszerte.46 Így nem lehet eléggé hangsúlyozni a célterápiák látens vírusokra és más mikroorganizmusokra gyakorolt ​​hatásának vizsgálatának fontosságát. A tanulmány célja a TNF-α, TH-17 és IL-17 antagonisták beadásának a vírusok, köztük a CMV, az EBV és a HPV aktiválására gyakorolt ​​hatásának prospektív vizsgálata, valamint a biológiai szerek hatásának vizsgálata a mikroorganizmusok felszíni kolonizációjának prevalenciájára. , beleértve a HPV-t, baktériumokat és gombákat, pikkelysömörben szenvedő betegeknél. Az új célzott szerek, például a tofacitinib, a szekukinumab és az apremilaszt mikrobiális hatását is tanulmányozni fogják.

Módszerek A betegek jellemzői és a vizsgálati ütemterv Olyan pikkelysömörben szenvedő betegeket is bevonunk, akik kapnak és jelenleg is kapnak TNF-α-t (etanercept és adalimumab) pikkelysömör kezelésére, egy harmadik beutalási központban Tajvan északi részén (National Tajvani Egyetemi Kórház (NTUH)) 2011 és 2011 között. 2015. Beleszámítjuk azokat a betegeket is, akik aláírták a beleegyezésüket a klinikai vizsgálatok alkalmazásához vagy az azokban való részvételhez, és jelenleg az usztekinumab, szekukinumab, tofacitinib (CP690,550) és apremilaszt célterápiáit alkalmazzák. Ezeket a klinikai vizsgálatokat az NTUH Kutatásetikai Bizottsága hagyta jóvá (NTUH-REC: ustekinumab, 200806022M; secukinumab, 201104022MA; tofacitinib, 201012013MA; apremilast, 201010022M). Maguk a betegek vagy gyámjaik tájékoztatáson alapuló beleegyezésüket írták alá ezen új gyógyszerek vizsgálati protokolljaihoz a vizsgálatba való belépés előtt. Vizsgálatunk minden résztvevőjének vagy gyámjának alá kell írnia egy másik, az NTUH Kutatásetikai Bizottsága (NTUH-REC No: 201106079RC) jóváhagyott beleegyező nyilatkozatát is.

Ez a projekt két kapcsolódó tanulmányból áll:

1. tanulmány

1. Azok a betegek, akiknél célzott szereket terveznek kapni:

   Ez a prospektív, megfigyeléses vizsgálat olyan psoriasisos betegeket foglal magában, akik célzott szereket fognak kapni. A beiratkozás után ellenőrizzük a CMV-t és az EBV IgG-t. A biológiai terápia megkezdése előtt, 12 és 24 héttel a célterápia megkezdése után, 12 héttel a célterápiák abbahagyása után vérmintát, szemöldökszőrzetet és bőrpikkelyt vesznek a betegektől. Vérmintákat küldenek a vírusterhelés ellenőrzésére, a CMV és EBV vírusterhelést pedig valós idejű PCR-rel határozzák meg. A bőrpikkelyek bakteriális, gombakultúrái és HPV DNS kimutatása is történik. A HPV tipizálását genechip segítségével határozzák meg, és félkvantitatívan mérik a HPV vírusterhelését. A demográfiai adatokat és a pikkelysömör aktivitási paramétereit, mint például a pikkelysömör területét és súlyossági indexét (PASI), összegyűjtik a kiinduláskor és minden vizsgálati látogatáson. Ennek a tanulmánynak a célja, hogy megvizsgálja a célterápia dinamikus hatását a mikroorganizmusokra, köztük a CMV-re, EBV-re, HPV-re, baktériumokra és gombákra pikkelysömörben szenvedő betegeknél.

   2. tanulmány

2. Célzott terápiában részesült betegek Projektünk második része, egy eset-kontroll vizsgálat olyan pikkelysömörben szenvedő betegeket foglal magában, akik több mint 3 hónapja kaptak célzott szereket. Kontrollcsoportként az életkornak és a betegség súlyosságának megfelelő pikkelysömörben szenvedő betegeket is felveszünk, akik nem kezelnek célzott szerekkel vagy más szisztémás pikkelysömör elleni szerekkel. Hasonlóképpen, a beiratkozás után a CMV és az EBV IgG ellenőrzése megtörténik. HPV kimutatás, a bőrpikkely baktérium-, gombakultúrája történt. Összehasonlítják a látens vírus, a vírus reaktiváció, a baktériumok és gombák bőrkolonizációjának prevalenciáját a célterápiával vagy anélkül kezelt pikkelysömörben szenvedő betegek között.

Ezenkívül a mikroorganizmus-vizsgálatokat a célterápiák abbahagyása után 12 héttel ismét megismétlik. Elemezzük a vírusszerológiai, baktérium- és gombatermesztési adatok dinamikus változásait a célterápiák leállítása után.

Vizsgálatunk ezen részének célja az volt, hogy felmérjük a bőr látens vírus- vagy mikroorganizmus-kolonizációjának státuszát a pikkelysömörben kezelt és célterápiával kezelt betegek között.

Mezőköves mintavétel a nem léziós bőrön HPV esetén A mintavételi területeket először Hibitane-nal megtisztítják, majd finoman ragasztószalaggal le kell ragasztani a felületi szennyeződések eltávolítására. Ezután egy felületes bőrkaparást végzünk a fej és a nyak területéről, amennyire csak lehetséges a pikkelysömör okozta plakkoktól, finom csiszolópapírral a stratum corneumot lecsiszoljuk, és összegyűjtjük a törmeléket a HPV kimutatásához.

Baktériumok és gombák tenyésztése a bőrredőkön A mintavételi területek Hibitane-nal történő megtisztítása után a bőrredőkből, beleértve a retroauricularis területeket, a inguinalis vagy a hónalj területeket is, steril vattacsomóval, majd gyengéd vattával mintát vesznek. a bőr törlése.

Hajmintavétel HPV esetén A szemöldök eltávolítása az egyes alanyokhoz használt új csipesszel történik. Csak az ép szőrtüszőket tartalmazó szőrszálakat gyűjtik össze HPV-vizsgálatokhoz.

A vírusterhelés meghatározása

Kvantitatív PCR CMV és EBV vírusterhelésre A teljes vérmintákat -80 ◦C-on tároltuk a vizsgálat előtt. A DNS-t 400 μl mintából extraháltuk a MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I-vel a MagNA Pure Compact Instrument (Roche Diagnostics) segítségével. Az oldat térfogata 100 μl volt. A vírus-DNS-eket ezt követően a laboratóriumban a virológiai diagnózis céljából végrehajtott "házon belüli" valós idejű PCR-vizsgálatokkal amplifikáltuk. A CMV esetében a hidrolízisszonda technológián alapuló valós idejű PCR-vizsgálatokat alkalmazták, a korábban leírtak szerint.48 Az EBV esetében a "házon belüli" valós idejű PCR vizsgálatot hibridizációs próbákkal végezték, amint azt korábban közöltük.49 A CMV amplifikációt ABI PRISM® 7500-on (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Franciaország) végeztük a következő ciklusparaméterekkel: 2 perc 50 °C-on és 10 perc 95 °C-on, majd 45 ciklus, egyenként 15 s-ból 95 °C-on. C és 1 perc 60 ◦ C-on (0,8 ◦ C/s felfelé és 1,6 ◦ C/s lefelé; 9600 emulációs mód). Az EBV vizsgálatot LightCycler® 1.5 (LC1.5; Roche Diagnostics). Az EBV vizsgálatot a következő ciklusparaméterekkel végeztük: 1 perc 50 ◦ C-on és 8 perc 95 ◦ C-on, majd 45 ciklus következett, amelyek mindegyike 10 mp-ből 95 ◦ C-on, 15 s-ból 58 °C-on és 15 s-ból 72 °C-on C-on, és 1 perces hűtési lépésben 40 ◦C-on (20 ◦C/s rámpa). A valós idejű PCR vizsgálatokat párhuzamosan végeztük az LC480-on, a kezdeti protokollok enyhe adaptációja után. 10 mikroliter extrahált DNS-t amplifikáltunk 25 μl keverékben, amely 1 × LightCycler® 480 Probes Mastert, 200 nM forward primert, 200 nM reverz primert, 100 nM hidrolízis próbát, 0,38 egység uracil-N-glikozilázt, Cergy-Ptrogen (Invitrogen) tartalmazott. ). Az EBV esetében az LC-Red 640-el jelölt hibridizációs próbát használtuk FAM-mal jelölt hidrolízis próbaként.49 Az LC480 protokollokban használt összes primer és próba szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Az LC480 ciklus körülményei a következők voltak: 2 perc 50 °C-on és 10 perc 95 °C-on, majd 45 ciklus következett, mindegyik 15 másodpercből 95 °C-on és 40 másodpercből 60 °C-on, valamint 30 másodperces hűtési lépésből. 40 ◦C-on (4,4 ◦C/s rámpasebesség). A CMV- és EBV-vizsgálatoknál a mennyiségi meghatározást standard görbével végeztük, amelyet a fertőzött sejttenyészetekből extrahált vírus-DNS 10-szeres sorozathígításaiból állítottunk elő, és plazmid segítségével határoztuk meg. A potenciális PCR-inhibitorok kimutatása érdekében minden DNS-kivonatot hígítatlanul és 1:10 hígítással teszteltünk. Az eredményeket logaritmikusan fejeztük ki (vírus kópiaszám/ml). Az extrakciós hígítást figyelembe véve az érzékenységi küszöb 1,4 log volt minden vizsgálatnál.

HPV genotipizálás és szemikvantitatív HPV vírusterhelés A HPV genechip (Easychip HPV Genotyping Array, King Car, Taipei, Tajvan) revert-blot hibridizációt kínál a HPV DNS 39 altípusának kimutatására (6, 11, 16, 18, 26, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 67, 68, 69, 70, 72 74, 82, CP8061, CP8304, L1AE5, MM4, MM7 és MM8) egyetlen reakcióban, amint azt Huang et al. Minden egyes minta HPV L1 régiójának beágyazott multiplex PCR termékeit genechippel hibridizálják. A másik beágyazott PCR-sorozatot szintén a bőrtípusú HPV esetében hajtják végre, amely FAP59/64 és Fap6319R/6085F, valamint DNS szekvenálási elemzésből állt. el kell végezni a termékre, hogy kizárják a koinfekció jelenlétét. A genechip több fertőzést is képes kimutatni, a bőrre irányított PCR szekvenálás pedig egyszerre csak egy HPV szerotípust képes kimutatni. Belső ellenőrzés az emberi genomi DNS kivonásához

1. . GAPDH, rés-1/rés-2 (kb. ~341 bp)
2. . Béta-globin, KW42/KW29 (kb. ~510 bp)
3. . Béta-globin, KC03/KC04 (kb. ~110 bp)
4. . Béta-globin, KC03/KC05 (kb. ~150 bp)

A nyálkahártya HPV kimutatásának stratégiája:

Primerek mDeAV1 5'-CGTCCM*ARRGGAWACTGATC-3' mDeAV2 5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3'-Biotin GAP1: 5'-CCAACTTTCCCGCCTCTCAGC-3' GAP2: 5'-AAAACCGCTAGTAGGCCGWGGAT9:3'CCGGGAT3 5'-GCTCACTCAGTGTGGCAAAG-3'

A bőrtípusú HPV kimutatásához a beágyazott PCR primer többi készletét a következőképpen kell használni:

FAP59：5'-TAACWGTIGGICAYCCWTATT-3') FAP64：5'-CCWATATCWVHCATITCICCCATC-3') FAP6085F：CCWGATCCHAATMRRTTGC FAP6319R：ACATTTGGGGGGAATCHAATTTD-ben a DNS-spektrum mennyisége szememtatív volt. A minta relatív fényegységében (RLU) mért lumineszcencia jelerősségeket standard pozitív kontrollokkal (RLU/PC) hasonlítottuk össze.