L'impatto della terapia mirata sui microrganismi nei pazienti con psoriasi

Introduzione Poiché numerosi studi hanno identificato TNF-α, TH-17 e IL-17 come ruoli particolarmente importanti che regolano la cascata infiammatoria nella psoriasi, le terapie target, inclusi gli antagonisti del TNF-α e TH-17, hanno rappresentato un importante passo avanti nel trattamento della psoriasi . È ben noto che il TNF-α svolge un ruolo importante nella risposta immunitaria alle infezioni virali, che è attribuito all'inibizione diretta della replicazione virale, all'uccisione delle cellule infettate dal virus, all'induzione delle vie effettrici dei linfociti T CD8+ FasL-dipendenti attraverso il TNF/ Interazione del recettore 2 del TNF e promozione indiretta della risposta infiammatoria. Inoltre, è stato dimostrato che il trattamento con antagonisti del TNF-α è associato a un aumento della replicazione virale nei ratti inoculati dal virus, alla progressiva perdita di cellule T CD4+ e CD8+ e alla diminuzione del livello di TNF-α e interferone. In alcuni pazienti trattati con antagonisti del TNF-α è stata osservata anche una transitoria diminuzione della risposta delle cellule T.10 Il TNF-α può inibire la produzione di CMV in alcuni tipi di cellule e il principale promotore precoce immediato del CMV è inibito dal TNF-α. È stato segnalato un aumento della produzione di TNF durante l'infezione da CMV, che mostra anche attività anti-CMV in vitro.

Il TNF-α è anche coinvolto nel controllo diretto dell'infezione da HPV mediante l'induzione dell'apoptosi delle cellule infette da HPV, l'arresto della crescita dei cheratinociti infetti da HPV e la down-regulation della trascrizione del gene HPV, la stimolazione della risposta infiammatoria e l'up-regulation della classe HLA I componenti nelle cellule presentanti l'antigene. È noto che la proteina E6 dell'HPV-16 si lega direttamente al recettore 1 del TNF e annulla l'apoptosi indotta dal TNF delle cellule ospiti. Studi recenti hanno dimostrato un'elevata prevalenza di DNA dell'HPV nella pelle psoriasica e un aumento degli anticorpi HPV5 nei pazienti con psoriasi. Sembra che la pelle psoriasica possa essere specificamente permissiva per l'HPV. Un aumento delle anomalie del pap test è stato osservato in pazienti con malattie infiammatorie intestinali che ricevevano antagonisti del TNF-α. Tuttavia, gli effetti specifici della terapia anti-TNF sulla portatrice dell'HPV e sulla malattia associata all'HPV rimangono sconosciuti.

Il virus di Epstein-Barr (EBV) è associato a diversi tumori maligni delle cellule B e delle cellule epiteliali, specialmente nei pazienti sottoposti a trattamento immunosoppressivo. È stato affrontato l'aumento del rischio di disturbi linfoproliferativi nei pazienti trattati con antagonisti del TNF-α. Sono stati descritti anche casi clinici di malattie linfoproliferative associate a EBV che sono regredite dopo la sospensione dei farmaci anti-TNF-α. Pertanto, la preoccupazione per l'aumento del rischio almeno in parte causato dall'immunosoppressione della terapia anti-TNF, che può causare una riattivazione consecutiva di EBV, è emersa ma non è stata ancora dimostrata.

I farmaci anti-TNF-α, inclusi gli anticorpi monoclonali contro il TNF-α (infliximab e adalimumab) e il recettore solubile del TNF (etanercept), sono riconosciuti come un fattore di rischio per le infezioni opportunistiche. Uno studio recente ha dimostrato un rischio più elevato di infezioni opportunistiche per i pazienti trattati con adalimumab rispetto a etanercept, con differenze di rischio da 10 a 17 volte. Tuttavia, la maggior parte delle conoscenze sulla riattivazione virale latente durante il trattamento anti-TNF proviene da studi su pazienti con malattia infiammatoria intestinale e artrite reumatoide. Inoltre, questi studi si concentrano principalmente sugli herpesvirus e sull'epatite virale. Sono stati segnalati anche diversi casi clinici in cui l'infezione da EBV, CMV e HPV ha complicato la terapia con antagonisti del TNF-α in pazienti con psoriasi.

IL-17 è una citochina proinfiammatoria prodotta da una varietà di cellule, tra cui un sottoinsieme recentemente identificato di cellule T CD4+ attivate (cellule Th17), cellule T γδ, cellule CD8+ e cellule NKT. Esistono prove a sostegno di un ruolo protettivo dell'IL-17 nella difesa dell'ospite contro le infezioni batteriche extracellulari, tra cui la polmonite da Klebsiella, 38 Bacteroides fragilis ed Escherichia coli. Uno studio recente ha anche mostrato che IL-17 è essenziale per l'immunità umana contro il comune fungo Candida albicans.

È stato riportato che vari batteri e funghi sono associati alla provocazione e/o all'esacerbazione della psoriasi. La prova più forte esiste per l'induzione della psoriasi guttata da una precedente infezione da Streptococcus pyogenes tonsillare. Balci et al hanno anche riscontrato tassi significativamente più elevati di colonizzazione da Staphylococcus aureus nella pelle lesionata e nelle narici dei pazienti con psoriasi rispetto ai controlli sani. Hanno anche suggerito una relazione significativa tra i punteggi PASI e sia la coltivazione di S. aureus che la produzione di tossine nella pelle lesionata dei pazienti con psoriasi.

Tuttavia, gli studi che hanno valutato l'impatto degli antagonisti del TNF-α, TH-17, IL-17 e altri agenti mirati nei pazienti con psoriasi sono limitati.

Obiettivo: A Taiwan, il tasso di sieropositività al CMV è di circa il 50% per i bambini in età scolare e superiore al 90% per gli adulti. L'EBV causa un'infezione persistente dei linfociti B in più del 90% della popolazione adulta mondiale.46 Pertanto, l'importanza di studiare l'influenza delle terapie target sui virus latenti e su altri microrganismi non può essere sottovalutata. Lo scopo di questo studio è indagare in modo prospettico l'effetto della somministrazione di antagonisti del TNF-α, TH-17 e IL-17 sull'attivazione di virus, inclusi CMV, EBV e HPV e l'impatto dei farmaci biologici sulla prevalenza della colonizzazione superficiale del microrganismo , inclusi HPV, batteri e funghi, in pazienti con psoriasi. Sarà inoltre studiato l'effetto microbico di nuovi agenti mirati, come tofacitinib, secukinumab e apremilast.

Metodi Caratteristiche dei pazienti e programma di studio Includiamo pazienti con psoriasi che riceveranno e che sono attualmente in TNF-α (etanercept e adalimumab) per la psoriasi, in un centro di riferimento terziario nel nord di Taiwan (National Taiwan University Hospital (NTUH)) tra il 2011 e 2015. Includiamo anche i pazienti che hanno firmato il consenso informato per utilizzare o partecipare agli studi clinici e stanno attualmente utilizzando le terapie target di ustekinumab, secukinumab, tofacitinib (CP690,550) e apremilast. Questi studi clinici sono approvati dal Comitato etico di ricerca della NTUH (NTUH-REC: ustekinumab, 200806022M; secukinumab, 201104022MA; tofacitinib, 201012013MA; apremilast, 201010022M). I pazienti stessi oi loro tutori hanno firmato il consenso informato per i protocolli di studio di questi nuovi farmaci prima dell'ingresso a questo studio. Tutti i partecipanti al nostro studio o i loro tutori devono anche firmare un altro consenso informato di questo studio, che è approvato dal Comitato etico della ricerca della NTUH (NTUH-REC No: 201106079RC).

Questo progetto si compone di due studi correlati:

Studio 1

1. Pazienti che dovrebbero ricevere agenti mirati:

   Questo studio prospettico osservazionale include pazienti affetti da psoriasi che riceveranno agenti mirati. Dopo l'arruolamento, vengono controllate le IgG per CMV ed EBV. I pazienti vengono sottoposti al prelievo di sangue, peli delle sopracciglia e scaglie cutanee prima dell'inizio della terapia biologica, 12 e 24 settimane dopo l'inizio delle terapie target, 12 settimane dopo l'interruzione delle terapie target. I campioni di sangue vengono inviati per controllare la carica virale e la carica virale di CMV ed EBV viene determinata mediante PCR in tempo reale. Vengono eseguite anche colture batteriche e fungine e il rilevamento del DNA dell'HPV delle scaglie cutanee. La tipizzazione dell'HPV è determinata mediante genechip e viene eseguita la misurazione semiquantitativa della carica virale dell'HPV. I dati demografici e i parametri di attività della psoriasi, come l'area della psoriasi e l'indice di gravità (PASI), vengono raccolti al basale e ad ogni visita dello studio. Lo scopo di questo studio è quello di indagare l'effetto dinamico della somministrazione di terapie target sui microrganismi, inclusi CMV, EBV, HPV, batteri e funghi in pazienti con psoriasi.

   Studio 2

2. Pazienti che hanno ricevuto una terapia mirata La seconda parte del nostro progetto, uno studio caso-controllo, include pazienti affetti da psoriasi che hanno ricevuto agenti mirati per più di 3 mesi. Reclutiamo anche pazienti con psoriasi abbinati per età e gravità della malattia che non stanno trattando con agenti mirati o altri agenti antipsoriasici sistemici come gruppo di controllo. Allo stesso modo, dopo l'arruolamento, vengono controllate le IgG per CMV ed EBV. Sono state eseguite la rilevazione dell'HPV, le colture batteriche e fungine delle scaglie cutanee. Viene eseguito il confronto della prevalenza del virus latente, della riattivazione del virus, della colonizzazione cutanea di batteri e funghi tra i pazienti affetti da psoriasi che stanno trattando con e senza terapie target.

Inoltre, gli esami dei microrganismi vengono ripetuti nuovamente 12 settimane dopo l'interruzione delle terapie target. Vengono analizzati i cambiamenti dinamici della sierologia virale, dei dati di coltivazione batterica e fungina dopo l'interruzione delle terapie target.

Lo scopo di questa parte del nostro studio era valutare qualsiasi differenza dello stato di colonizzazione latente di virus o microrganismi nelle pelli tra pazienti affetti da psoriasi trattati con e senza terapie target.

Campionamento in scala sulla pelle non lesionata per HPV Le aree di campionamento verranno prima pulite con Hibitane e delicatamente nastrate con nastri adesivi per rimuovere la contaminazione superficiale. Quindi viene prelevato un raschiamento cutaneo superficiale dalle zone della testa e del collo, il più lontano possibile da eventuali placche psoriasiche, utilizzando una carta vetrata fine per abradere lo strato corneo e raccogliendo i detriti per la rilevazione dell'HPV.

Coltivazione di batteri e funghi sulle pieghe cutanee Dopo aver ripulito le aree di campionamento con Hibitane, i campioni di tampone cutaneo vengono prelevati dalle pieghe cutanee, comprese le aree retroauricolari, le aree inguinali o ascellari, utilizzando un batuffolo di cotone sterile imbevuto di acqua bidistillata e quindi un tampone della pelle.

Il campionamento dei capelli per l'HPV Le sopracciglia vengono strappate con nuove pinzette utilizzate per ogni soggetto. Per gli studi sull'HPV vengono raccolti solo i capelli contenenti follicoli piliferi intatti.

Determinazione delle cariche virali

PCR quantitativa per la carica virale di CMV ed EBV I campioni di sangue intero sono stati conservati a -80 ◦C prima del test. Il DNA è stato estratto da 400 μL di campione con il kit MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation I utilizzando lo strumento MagNA Pure Compact (Roche Diagnostics). Il volume della soluzione era di 100 μL. I DNA virali sono stati quindi amplificati utilizzando i test PCR in tempo reale "interni" implementati in laboratorio per la diagnosi virologica. Per il CMV, sono stati utilizzati saggi di PCR in tempo reale basati sulla tecnologia della sonda di idrolisi, come descritto in precedenza.48 Per EBV, è stato eseguito il test PCR in tempo reale "in-house" utilizzando sonde di ibridazione, come riportato in precedenza.49 L'amplificazione del CMV è stata eseguita su ABI PRISM® 7500 (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Francia) utilizzando i seguenti parametri di ciclo: 2 min a 50 ◦C e 10 min a 95 ◦C, seguiti da 45 cicli ciascuno costituito da 15 s a 95 ◦ C e 1 min a 60 ◦C (rampa di 0,8 ◦C/s in salita e 1,6 ◦C/s in discesa; modalità di emulazione 9600). Il test EBV è stato eseguito su LightCycler® 1.5 (LC1.5; Diagnostica Roche). Il test EBV è stato eseguito con i seguenti parametri del ciclo: 1 min a 50 ◦C e 8 min a 95 ◦C, seguiti da 45 cicli ciascuno costituito da 10 s a 95 ◦C, 15 s a 58 ◦C e 15 s a 72 ◦ C e una fase di raffreddamento di 1 min a 40 ◦C (velocità di rampa di 20 ◦C/s). I test PCR in tempo reale sono stati eseguiti in parallelo sull'LC480, dopo lievi adattamenti rispetto ai protocolli iniziali. Dieci microlitri di DNA estratto sono stati amplificati in 25 μL di miscela contenente 1 × LightCycler® 480 Probes Master, primer forward 200 nM, primer reverse 200 nM, sonda idrolisi 100 nM, 0,38 unità uracil-N-glicosilasi (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Francia ). Per EBV, la sonda di ibridazione marcata con LC-Red 640 è stata utilizzata come sonda di idrolisi marcata con FAM.49 Le sequenze di tutti i primer e le sonde utilizzate nei protocolli LC480 sono indicate nella Tabella 1. Le condizioni di ciclo su LC480 erano le seguenti: 2 min a 50 ◦C e 10 min a 95 ◦C, seguiti da 45 cicli ciascuno costituito da 15 s a 95 ◦C e 40 s a 60 ◦C, e una fase di raffreddamento di 30 s a 40 ◦C (velocità di rampa di 4,4 ◦C/s). Per i saggi CMV ed EBV, la quantificazione è stata ottenuta con una curva standard generata da diluizioni seriali 10 volte di DNA virale estratto da colture cellulari infette e quantificato utilizzando un plasmide. Per rilevare potenziali inibitori della PCR, tutti gli estratti di DNA sono stati testati non diluiti e con una diluizione di 1:10. I risultati sono stati espressi in modo logaritmico (numero di copie virali/mL). Data la diluizione dell'estrazione, la soglia di sensibilità era di 1,4 log per tutti i dosaggi.

Genotipizzazione dell'HPV e carica virale semiquantitativa dell'HPV Il genechip dell'HPV (Easychip HPV Genotyping Array, King Car, Taipei, Taiwan) offrirà un'ibridazione revert-blot per rilevare 39 sottotipi di DNA dell'HPV (6, 11, 16, 18, 26, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 67, 68, 69, 70, 72, 74, 82, CP8061, CP8304, L1AE5, MM4, MM7 e MM8) in una singola reazione, come riportato da Huang et al. I prodotti di PCR multiplex annidati della regione L1 di HPV di ciascun campione saranno ibridati con un genechip. L'altra serie di PCR nidificata verrà eseguita anche per l'HPV di tipo cutaneo che consisteva in FAP59/64 e Fap6319R/6085F e analisi di sequenziamento del DNA. da eseguire sul prodotto per escludere la presenza di coinfezione. Il genechip è in grado di rilevare più infezioni e il sequenziamento della PCR diretta sulla pelle può rilevare solo un sierotipo di HPV alla volta. Controllo interno per l'estrazione di DNA genomico umano

1. . GAPDH, gap-1/gap-2 (ca. ~341 bp)
2. . Beta-globina, KW42/KW29 (ca. ~510 bp)
3. . Beta-globina, KC03/KC04 (ca. ~110 bp)
4. . Beta-globina, KC03/KC05 (ca. ~150 bp)

Strategia di rilevamento dell'HPV della mucosa:

Primer mDeAV1 5'-CGTCCM*ARRGGAWACTGATC-3' mDeAV2 5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3'-Biotin GAP1: 5'-CCAACTTTCCCGCCTCTCAGC-3' GAP2: 5'-AAAACCGCTAGTAGCCGGGCC-3' KW29: 5'-GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG-3' KW42: 5'-GCTCACTCAGTGTGGCAAAG-3'

Per il rilevamento dell'HPV di tipo cutaneo, gli altri set di primer PCR nidificati verranno utilizzati come:

FAP59：5'-TAACWGTIGGICAYCCWTATT-3') FAP64：5'-CCWATATCWVHCATITCICCATC-3') FAP6085F：CCWGATCCHAATMRRTTGC FAP6319R：ACATTTGGGGGAAAAATTGTTTDGGRTCAA La quantità di DNA dell'HPV nel campione è stata determinata con metodo semiquantitativo. Le intensità del segnale di luminescenza nelle unità di luce relativa (RLU) del campione sono state confrontate con i controlli positivi standard (RLU/PC).