De impact van gerichte therapie op micro-organismen bij patiënten met psoriasis

Inleiding Aangezien tal van studies TNF-α, TH-17 en IL-17 hebben geïdentificeerd als bijzonder belangrijke rollen die de ontstekingscascade bij psoriasis beheersen, hebben doeltherapieën, waaronder TNF-α- en TH-17-antagonisten, een grote doorbraak betekend in de behandeling van psoriasis. . Het is algemeen bekend dat TNF-α een belangrijke rol speelt in de immuunrespons op virale infecties, die wordt toegeschreven aan directe remming van virale replicatie, het doden van viraal geïnfecteerde cellen, inductie van FasL-afhankelijke CD8+ T-lymfocyten-effectorroutes via TNF/ TNF-receptor 2-interactie en indirect de ontstekingsreactie bevorderen. Bovendien is aangetoond dat behandeling met TNF-α-antagonisten gepaard gaat met verhoogde virale replicatie bij met virus geïnoculeerde ratten, progressief verlies van CD4+- en CD8+-T-cellen en een verlaagd niveau van TNF-α- en interferon. Bij sommige patiënten die met TNF-α-antagonisten werden behandeld, werd ook een voorbijgaande verminderde T-celreactiviteit waargenomen.10 TNF-a kan de productie van CMV in bepaalde celtypen remmen en de belangrijkste onmiddellijke vroege promoter van CMV wordt geremd door TNF-a. Verhoogde TNF-productie is gemeld tijdens CMV-infectie, die ook in vitro anti-CMV-activiteit vertoont.

TNF-α is ook betrokken bij de directe controle van HPV-infectie door inductie van apoptose van met HPV geïnfecteerde cellen, het stoppen van de groei van met HPV geïnfecteerde keratinocyten en neerwaartse regulatie van HPV-gentranscriptie, stimulatie van ontstekingsreactie en opwaartse regulatie van HLA-klasse I-componenten in antigeenpresenterende cellen. Van het E6-eiwit van HPV-16 is bekend dat het direct bindt aan TNF-receptor 1 en TNF-geïnduceerde apoptose van de gastheercellen opheft. Recente onderzoeken hebben een hoge prevalentie van HPV-DNA in de psoriatische huid en verhoogde HPV5-antilichamen bij patiënten met psoriasis aangetoond. Het lijkt erop dat de psoriatische huid specifiek tolerant is voor HPV. Bij patiënten met inflammatoire darmaandoeningen die TNF-α-antagonisten kregen, zijn verhoogde afwijkingen in het uitstrijkje waargenomen. De specifieke effecten van anti-TNF-therapie op HPV-dragerschap en HPV-geassocieerde ziekte blijven echter onbekend.

Het Epstein-Barr-virus (EBV) wordt in verband gebracht met verschillende B-cel- en epitheelcelmaligniteiten, vooral bij patiënten die een immunosuppressieve behandeling ondergaan. Er is aandacht besteed aan een verhoogd risico op lymfoproliferatieve aandoeningen bij patiënten die worden behandeld met TNF-α-antagonisten. Casusrapporten van EBV-geassocieerde lymfoproliferatieve ziekten die achteruit gingen na stopzetting van anti-TNF-α-geneesmiddelen waren ook beschreven. De bezorgdheid over het verhoogde risico dat ten minste gedeeltelijk wordt veroorzaakt door immunosuppressie van anti-TNF-therapie, die een opeenvolgende EBV-reactivering kan veroorzaken, ontstond dus, maar was nog niet bewezen.

Anti-TNF-α-geneesmiddelen, waaronder monoklonale antilichamen tegen TNF-α (infliximab en adalimumab) en oplosbare TNF-receptor (etanercept), worden erkend als een risicofactor voor opportunistische infecties. Een recent onderzoek toonde een hoger risico op opportunistische infecties aan bij patiënten die adalimumab kregen dan bij patiënten die etanercept kregen, met een 10- tot 17-voudig verschil in risico. De meeste kennis over latente virale reactivering tijdens anti-TNF-behandeling is echter afkomstig van onderzoeken bij patiënten met inflammatoire darmaandoeningen en reumatoïde artritis. Bovendien richten deze studies zich vooral op herpesvirussen en virale hepatitis. Er zijn ook verschillende casusrapporten gemeld waarin EBV-, CMV- en HPV-infectie de therapie met TNF-α-antagonisten bij patiënten met psoriasis bemoeilijkten.

IL-17 is een pro-inflammatoir cytokine dat wordt geproduceerd door een verscheidenheid aan cellen, waaronder een nieuw geïdentificeerde subset van geactiveerde CD4+ T-cellen (Th17-cellen), γδT-cellen, CD8+-cellen en NKT-cellen. Er zijn aanwijzingen dat IL-17 een beschermende rol speelt in de afweer van de gastheer tegen extracellulaire bacteriële infecties, waaronder Klebsiella-pneumonie38, Bacteroides fragilis en Escherichia coli. Een recente studie toonde ook aan dat IL-17 essentieel is voor de menselijke immuniteit tegen de gewone schimmel Candida albicans.

Van verschillende bacteriën en schimmels is gemeld dat ze in verband worden gebracht met provocatie en/of verergering van psoriasis. Het sterkste bewijs bestaat voor de inductie van psoriasis guttata door een voorafgaande tonsilaire Streptococcus pyogenes-infectie. Balci et al vonden ook significant hogere percentages van Staphylococcus aureus-kolonisatie in laesiehuid en neusgaten van de patiënten met psoriasis dan gezonde controles. Ze suggereerden ook een significante relatie tussen PASI-scores en zowel S. aureus-kweek als toxineproductie in de laesiehuid van de patiënten met psoriasis.

De onderzoeken naar de impact van TNF-α-, TH-17-, IL-17-antagonisten en andere gerichte middelen bij patiënten met psoriasis zijn echter beperkt.

Doel: In Taiwan is het seropositieve percentage van CMV ongeveer 50% voor schoolgaande kinderen en meer dan 90% voor volwassenen. EBV veroorzaakt een aanhoudende infectie van B-lymfocyten bij meer dan 90% van de volwassen bevolking wereldwijd.46 Het belang van het onderzoeken van de invloed van doeltherapieën op de latente virussen en andere micro-organismen kan dus niet genoeg worden benadrukt. Het doel van deze studie is om prospectief het effect te onderzoeken van toediening van TNF-α-, TH-17- en IL-17-antagonisten op de activering van virussen, waaronder CMV, EBV en HPV, en de impact van biologische geneesmiddelen op de prevalentie van oppervlaktekolonisatie van micro-organismen. , waaronder HPV, bacteriën en schimmels, bij patiënten met psoriasis. Het microbiële effect van nieuwe gerichte middelen, zoals tofacitinib, secukinumab en apremilast, zal ook worden bestudeerd.

Methoden Patiëntkenmerken en studieschema We includeren patiënten met psoriasis die tussen 2011 en 2011 TNF-α (etanercept en adalimumab) voor psoriasis krijgen en die momenteel TNF-α (etanercept en adalimumab) gebruiken in een tertiair verwijzingscentrum in het noorden van Taiwan (National Taiwan University Hospital (NTUH)). 2015. We nemen ook patiënten op die geïnformeerde toestemming hebben ondertekend om de klinische onderzoeken te gebruiken of eraan deel te nemen en die momenteel de doeltherapieën van ustekinumab, secukinumab, tofacitinib (CP690,550) en apremilast gebruiken. Deze klinische onderzoeken zijn goedgekeurd door de Research Ethics Committee van de NTUH (NTUH-REC: ustekinumab, 200806022M; secukinumab, 201104022MA; tofacitinib, 201012013MA; apremilast, 201010022M). Patiënten zelf of hun voogden hebben geïnformeerde toestemming ondertekend voor de onderzoeksprotocollen van deze nieuwe geneesmiddelen voordat ze aan deze studie beginnen. Alle deelnemers aan onze studie of hun voogden moeten ook een andere geïnformeerde toestemming voor deze studie ondertekenen, die is goedgekeurd door de Research Ethics Committee van de NTUH (NTUH-REC nr: 201106079RC).

Dit project bestaat uit twee gerelateerde onderzoeken:

Studie 1

1. Patiënten die gepland zijn om gerichte middelen te krijgen:

   Deze prospectieve, observationele studie omvat psoriasispatiënten die gerichte middelen zullen krijgen. Na inschrijving worden CMV en EBV IgG gecontroleerd. Patiënten ondergaan bloedmonsters, wenkbrauwharen en huidschilfers vóór de start van de biologische therapie, 12 en 24 weken na de start van de doeltherapieën, 12 weken na stopzetting van de doeltherapieën. Er worden bloedmonsters verzonden om de virale belasting te controleren en de CMV- en EBV-virale belasting wordt bepaald door middel van real-time PCR. Bacterie-, schimmelculturen en HPV-DNA-detectie van huidschilfers worden ook uitgevoerd. HPV-typering wordt bepaald door genechip en er wordt een semi-kwantitatieve meting van de HPV-virale belasting uitgevoerd. Demografische gegevens en de activiteitsparameters van de psoriasis, zoals psoriasisgebied en ernstindex (PASI), worden verzameld bij aanvang en bij elk studiebezoek. Het doel van deze studie is om het dynamische effect te onderzoeken van de toediening van doeltherapieën op de micro-organismen, waaronder CMV, EBV, HPV, bacteriën en schimmels bij patiënten met psoriasis.

   Studie 2

2. Patiënten die gerichte therapie hebben gekregen Het tweede deel van ons project, een case-control studie, omvat psoriasispatiënten die gedurende meer dan 3 maanden gerichte middelen hebben gekregen. We rekruteren ook psoriasispatiënten die qua leeftijd en ziekte-ernst overeenkomen en die niet worden behandeld met doelgerichte middelen of andere systemische antipsoriatica als controlegroep. Evenzo worden CMV en EBV IgG na inschrijving gecontroleerd. HPV-detectie, bacteriële, schimmelculturen van de huidschilfers werden gedaan. Vergelijking van de prevalentie van latent virus, virusreactivering, huidkolonisatie van bacteriën en schimmels tussen psoriasispatiënten die met en zonder doeltherapieën worden behandeld.

Bovendien worden de micro-organismenonderzoeken 12 weken na het staken van de doeltherapieën nogmaals herhaald. De dynamische veranderingen van virale serologie, bacterie- en schimmelkweekgegevens na het stoppen van doeltherapieën worden geanalyseerd.

Het doel van dit deel van onze studie was het beoordelen van enig verschil in de status van latente kolonisatie van virussen of micro-organismen in de huid tussen psoriasispatiënten die werden behandeld met en zonder doeltherapieën.

Schaalbemonstering op de niet-laesiehuiden voor HPV De bemonsteringsgebieden worden eerst schoongemaakt met Hibitane en voorzichtig afgeplakt met plakband om oppervlakteverontreiniging te verwijderen. Vervolgens wordt een oppervlakkig huidschraapsel van de hoofd- en nekgebieden genomen, zo ver mogelijk van eventuele psoriatische plaques, waarbij een fijn schuurpapier wordt gebruikt om het stratum corneum te schuren en het vuil op te vangen voor HPV-detectie.

Kweken van bacteriën en schimmels op de huidplooien Na het vrijmaken van bemonsteringsgebieden met Hibitane, worden huiduitstrijkjes genomen van huidplooien, inclusief retroauriculaire gebieden, lies- of okselgebieden, met behulp van een steriel wattenstaafje gedoopt in dubbel gedestilleerd water en vervolgens een zachte afvegen van de huid.

Haarmonsters voor HPV Wenkbrauwen worden geplukt met een nieuw pincet dat voor elk onderwerp wordt gebruikt. Alleen haren met intacte haarzakjes worden verzameld voor HPV-onderzoeken.

Bepaling van virale ladingen

Kwantitatieve PCR voor CMV- en EBV-virale belasting Volbloedmonsters werden vóór het testen bij -80 ◦C bewaard. DNA werd geëxtraheerd uit 400 μl monster met de MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation kit I met behulp van het MagNA Pure Compact Instrument (Roche Diagnostics). Het volume van de oplossing was 100 μl. Virale DNA's werden vervolgens geamplificeerd met behulp van de "in-house" real-time PCR-assays die in het laboratorium zijn geïmplementeerd voor virologische diagnose. Voor CMV werden real-time PCR-testen op basis van hydrolyseprobetechnologie gebruikt, zoals eerder beschreven.48 Voor EBV werd de "in-house" real-time PCR-assay met behulp van hybridisatieprobes uitgevoerd, zoals eerder gerapporteerd.49 CMV-amplificatie werd uitgevoerd op de ABI PRISM® 7500 (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Frankrijk) met behulp van de volgende cyclusparameters: 2 min bij 50 ◦C en 10 min bij 95 ◦C, gevolgd door 45 cycli die elk bestaan ​​uit 15 s bij 95 ◦ C en 1 min bij 60 ◦C (toenamesnelheden van 0,8 ◦C/s omhoog en 1,6 ◦C/s omlaag; 9600 emulatiemodus). EBV-assay werd uitgevoerd op de LightCycler® 1.5 (LC1.5; Roche Diagnostiek). EBV-assay werd uitgevoerd met de volgende cyclusparameters: 1 min bij 50 ◦C en 8 min bij 95 ◦C, gevolgd door 45 cycli die elk bestonden uit 10 s bij 95 ◦C, 15 s bij 58 ◦C en 15 s bij 72 ◦ C, en een koelstap van 1 min bij 40 ◦C (stijgingssnelheid van 20 ◦C/s). Realtime PCR-assays werden parallel uitgevoerd op de LC480, na kleine aanpassingen ten opzichte van de oorspronkelijke protocollen. Tien microliter geëxtraheerd DNA werd geamplificeerd in 25 μl mengsel dat 1 × LightCycler® 480 Probes Master, 200 nM forward primer, 200 nM reverse primer, 100 nM hydrolyseprobe, 0,38 eenheden uracil-N-glycosylase (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Frankrijk ). Voor EBV werd de hybridisatieprobe gelabeld met LC-Red 640 gebruikt als een FAM-gelabelde hydrolyseprobe.49 De sequenties van alle primers en probes die in LC480-protocollen worden gebruikt, zijn aangegeven in tabel 1. De cycluscondities op de LC480 waren als volgt: 2 min bij 50 ◦C en 10 min bij 95 ◦C, gevolgd door 45 cycli elk bestaande uit 15 s bij 95 ◦C en 40 s bij 60 ◦C, en een koelstap van 30 s bij 40 ◦C (stijgingssnelheid van 4,4 ◦C/s). Voor CMV- en EBV-assays werd kwantificering bereikt met een standaardcurve die werd gegenereerd uit 10-voudige seriële verdunningen van viraal DNA geëxtraheerd uit geïnfecteerde celculturen en gekwantificeerd met behulp van een plasmide. Om mogelijke PCR-remmers te detecteren, werden alle DNA-extracten onverdund en in een verdunning van 1:10 getest. De resultaten werden logaritmisch uitgedrukt (aantal virale kopieën/ml). Gezien de extractieverdunning was de gevoeligheidsdrempel 1,4 log voor alle assays.

HPV-genotypering en semikwantitatieve HPV-virale belasting De HPV-genechip (Easychip HPV Genotyping Array, King Car, Taipei, Taiwan) biedt een revert-blot-hybridisatie om 39 subtypes van HPV-DNA te detecteren (6, 11, 16, 18, 26, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 67, 68, 69, 70, 72, 74, 82, CP8061, CP8304, L1AE5, MM4, MM7 en MM8) in een enkele reactie, zoals beschreven door Huang et al. De geneste multiplex PCR-producten van het L1-gebied van HPV van elk exemplaar zullen worden gehybridiseerd met een genechip. De andere set geneste PCR zal ook worden uitgevoerd voor huidtype HPV, die bestond uit FAP59/64 en Fap6319R/6085F en DNA-sequencinganalyse. worden uitgevoerd voor het product om de aanwezigheid van co-infectie uit te sluiten. De genechip kan meerdere infecties detecteren en de huidgerichte PCR-sequencing kan slechts één serotype HPV tegelijk detecteren. Interne controle voor het extraheren van menselijk genomisch DNA

1. . GAPDH, gap-1/gap-2 (ca. ~ 341 basispunten)
2. . Beta-globine, KW42/KW29 (ca. ~ 510 basispunten)
3. . Beta-globine, KC03/KC04 (ca. ~ 110 basispunten)
4. . Beta-globine, KC03/KC05 (ca. ~ 150 basispunten)

Strategie voor mucosale HPV-detectie:

Primers mDeAV1 5'-CGTCCM*ARRGGAWACTGATC-3' mDeAV2 5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3'-Biotine GAP1: 5'-CCAACTTTCCCGCCTCTCAGC-3' GAP2: 5'-AAAACCGCTAGTAGCCGGGCC-3' KW29: 5'-GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG-3' KW42: 5'-GCTCACTCAGTGTGGCAAAG-3'

Voor de detectie van huidtype HPV worden de andere sets geneste PCR-primers gebruikt als:

FAP59：5'-TAACWGTIGGICAYCCWTATT-3') FAP64：5'-CCWATATCWVHCATITCICCATC-3') FAP6085F:CCWGATCCHAATMRRTTGC FAP6319R:ACATTTGGGGGAAAAATTGTTTDGGRTCAA De hoeveelheid HPV-DNA in het monster werd bepaald met een semikwantitatieve methode. Luminescentiesignaalsterkten in relatieve lichteenheden (RLU) van het monster werden vergeleken met standaard positieve controles (RLU/PC).