クローン病の小児患者における代謝プロファイル、腸透過性、微生物叢、サイトカインおよびケモカインの発現およびその他の炎症マーカーに対するプロバイオティクス製剤 (VSL#3) の効果に関する前向き、プラセボ対照、二重盲検、クロスオーバー研究

小児期の炎症性腸疾患 (IBD) は、成長と発達に大きな影響を与える慢性的な再発および寛解性の炎症状態です。

IBD は、規制された腸の免疫応答から、抑制されていない免疫細胞の活性化と炎症誘発性サイトカインの産生によって引き起こされるものへの移行を伴います。 (1) この免疫刺激の増加の原因は非常に興味深いものであり、いくつかの研究は病気の進行における共生細菌の役割を示しています。 (2) 最近の研究では、IBD 患者の微生物叢を非 IBD コントロールの微生物叢と比較し、それらの組成に有意な差があることが明らかになりました。 IBD 患者の微生物叢は、非 IBD コントロールに代表される Firmicutes と Bacteroides の枯渇を特徴とする異常な微生物組成を示しました。 (3)

強化された NF-κB 活性は、IBD の両方の形態の病理学に関与しています。 クローン病 (CD) および潰瘍性大腸炎 (UC)。 CD および UC におけるプロテアソームを介した NF-κB 活性化のメカニズムが研究されています。 Visekruna らは、プロテアソームのサブユニット組成とタンパク質分解機能が UC と CD で異なることを実証しました。 免疫プロテアソーム サブユニット β1i および β2i の高発現は、CD の炎症を起こした粘膜の特徴です (4)。 これに沿って、彼らは、CD患者の粘膜から分離された免疫プロテアソームによる、NF-κB前駆体p105の強化されたプロセシングおよびNF-κBの阻害剤であるIκBαの分解を発見した。 健常対照者および CD 患者と比較して、UC 患者は、プロテアソームを介した NF-κB コンポーネントのプロセシング/分解に関して中間の表現型を示しました (4)。の CD 患者は、p50/c-Rel が、IL-12 による Th1 応答を介した IFN-γ を介した免疫プロテアソームの誘導に重要であることを示唆しています。 これらの発見は、異なるプロテアソーム サブユニットが IBD 患者の NF-κB を介した炎症の強度に影響を与えることを示唆しています (4)。

Pagnini C らの研究では、著者らは、プロバイオティック混合物 VSL#3 が CD-回腸炎の SAMP マウスモデルで腸の炎症の発症を防ぐことを報告しています。 これらの効果は、腸上皮に対する局所的効果（すなわち、正常な腸上皮バリア機能の回復と相まって、上皮細胞におけるTNF-α産生およびNF-κB活性化の刺激）と関連していた。

処理されたマウスの便と回腸粘膜の細菌 DNA の分析は、プロバイオティクス株の有意な増加を示し、プロバイオティクス処理の有益な効果には効果的な細菌の定着が必要であることを示唆しています。 この研究は、プロバイオティクスが炎症の抑制ではなく、上皮の先天性反応の刺激 (すなわち、TNF-α 発現の刺激) を含むメカニズムを通じて腸の健康を促進するという仮説を支持しています。 (5)

動物実験では、多くの細菌種の単独または組み合わせが IBD の症状を改善し、腸の炎症を軽減することが示されています。 プロバイオティクス製剤 VSL#3 で大腸炎のマウスを治療すると、IL-10 の産生と TGFβ 発現 T 細胞の割合が増加しました。 VSL#3 処理マウスから固有層単核細胞を移入すると、レシピエント マウスの大腸炎が予防され、VSL#3 が細胞の保護集団の生成を開始できることが示されました。 (6)

強力な抗炎症特性を持つ共生細菌の最近の同定、および病気の間にそれらの相関的な不在は、人間の健康の特定の側面が微生物叢の状態に依存する可能性があることを示唆しています. （7）

さらに、リポ多糖 (LPS) は、細菌性外膜の主要成分であり、敗血症性ショックの媒介に大きく関与しています。 通常、体は腸内腔に存在する高濃度の LPS に反応しません。 腸内アルカリホスファターゼ (IAP) は、LPS を加水分解し、共生細菌叢で腸の恒常性を維持することにより、LPS を解毒するようです。 (8)

プロバイオティクスは、腸内微生物叢の組成を調節します。 グローバル マイクロ アレイと bioinformatica 分析により、IL10-KO マウスにおける Th1 転写因子の上昇によって支配される免疫応答、食作用、および炎症経路の増強が明らかになりました。 プロバイオティクス VSL#3 を経口投与された IL10-KO マウスは、TLR シグナル伝達や、T 細胞、B 細胞受容体シグナル伝達などの関連するエフェクター経路を含むこれらの炎症経路の部位特異的なダウンレギュレーションを示しました。 さらに重要なことに、VSL#3 は、PPAR シグナル伝達、脂質、窒素、アミノ酸、および生体異物代謝のアップレギュレーションを引き起こしました (9)。

実際、VSL#3 による微生物組成の変化が腸の炎症状態にどのように影響するかは不明です。 VSL#3 が防御微生物の存在を促進する可能性があります。これは、宿主の生来の反応に直接影響を与えるプロバイオティクス自体の構成要素である可能性があります。 VSL#3 は、バリア機能、腸透過性、および先天的な宿主機能を調節することが報告されており、これらが変化すると、大腸炎の状態に深刻な影響を与える可能性があります。 VSL#3 は、IL10_/_ マウスの上皮透過性を低下させ、腸の炎症を軽減することでバリア機能を強化することが示されています。 別の最近の研究では、VSL#3 が SAMP1/YitFc マウスにおける回腸炎の発症を、上皮バリア機能を強化し、NF-jB 活性化につながる先天的シグナル伝達を活性化することによって防止することが実証されました。 これらの効果は、VSL#3 分泌産物によって媒介されるようです。 これは、プロバイオティクス由来の因子が宿主の反応と実験的大腸炎を調節できることを示す報告と一致しています。 さらに、プロバイオティクス細菌に存在する構造成分は、免疫応答に大きな影響を与え、IL-10 などの免疫抑制分子の産生を助長する可能性があります (10)。

目的：

この研究の目的は、寛解期のクローン病 (CD) の小児患者における代謝プロファイル、腸透過性、微生物叢、サイトカインとケモカインの発現、およびその他の炎症マーカーに対するプロバイオティクス製剤 VSL#3 とプラセボの効果を評価することです。 (11)。

二次的な目的は次のとおりです。

• 小児クローン病活動指数 (PCDAI) への影響を判断するには
• プラセボと比較した VSL#3 の CD 小児患者のフレアまでの時間を決定する
• フレアが発生した場合、VSL#3 との併用療法がフレアの重症度を軽減するかどうかを評価する
• CDの小児患者における高用量のVSL #3による治療の安全性と忍容性を評価する

研究デザイン

この調査は、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、クロスオーバー試験になります。 この研究には、CDの30人の子供が含まれ、次のように6か月で明確になります。 年齢と性別が同等の 10 人のボランティアの健康な子供のグループが、代謝プロファイルの分析のための参照グループとして使用されます。

これらの子供たちは、体重に応じて 1 日あたり 9,000 億個のバクテリアを含む VSL#3 を 1 ～ 2 個のパケットで 2 か月間受け取る治療グループと、プラセボ薬を受け取るグループに無作為に割り付けられます。 治療またはプラセボへの割り当ては、コンピューターで生成されたランダム化スキームに従って決定されます。 薬は、各訪問時に治験責任医師によって調剤されます。コンプライアンスは、返されたバッグを数え、患者に質問することによって評価されます。 優れたコンプライアンスは、治験薬の摂取に関してプロトコルに違反していないこととして定義されます。 8 週間の終了時に、製剤を投与しない 6 週間の「ウォッシュアウト」期間が行われます。 その後、各患者は他のグループに切り替えられ、さらに8週間同様に追跡されます.

すべての患者は、研究期間を通じて定期的な投薬を継続します（5-ASAに関連するアザチオプリンまたは関連しないアザチオプリン）。

患者は、ベースライン時および研究が完了するまで8週間ごと、24週間または再発時に臨床的に評価されます。 来院ごとに、疾患活動性（便の頻度、便の硬さ、血便、腹痛、疾患の腸管外症状、および全体的な患者の機能）に関する患者アンケートを含むデータが収集されます。 最初の訪問時に収集された追加情報には、人口統計データ、家族歴、および症状の発症が含まれていました。 身体検査は、小児科医による各訪問で行われ、腹部検査とCDの腸外症状の検査が含まれます。 CD、セロビオース/マンニトール小腸透過性研究、便培養、便カルプロテクチンの定期的な血液検査は、訪問のたびに、および/または再発時に行われます。 尿は、一次元および二次元の高分解能 1 H NMR 分光法による代謝プロファイルの分析のために収集されます。 10人の健康なボランティアの子供と患者では、胆汁酸、イソロイシン、ロイシン、バリン、2-オキソ-3メチル-吉草酸、2-オキソ-イソ吉草酸、2-メチル-3-ヒドロキシ酪酸、3-ヒドロキシ酪酸、3-ヒドロキシ酪酸、 3-ヒドロキシイソ吉草酸、スレオニン、乳酸、3-ヒドロキシメチルグルタミン酸、アラニン、N-アセチルアスパラギン+グルタミン酸アスパルチル+グルタミル酸、酢酸、カルニチン、アセトン、アセト酢酸、2-ヒドロキシグルタル酸、ピルビン酸、グルタル酸、N-アセチルグルタミン酸、コハク酸、3-ヒドロキシ-3-メチルグルカル酸、ジメチルアミン、サルコシン、N-アセチル-アスパルチル-グルタミン酸、ジメチルグリシン、クエン酸、クレアチン、クレアチニン、コリン、ベタイン、マロン酸、トリメチルアミンオキシド、サルコシン、グリシン、1-メチルヒスチジン、3 -メチルヒスチジン、ベンゾイルグリシン（馬尿酸）、N-メチルベタイン（トリゴネリナ）、アラビノシオ、ウラシル、グアノシン、チロシン、フェニルアラニン、キサンチン、ヒポキサンチン、3-メチルヒスチジンが評価されます。 さらに、CD の小児では、薬物やその他の化合物をそのまま摂取したり、体の代謝や腸内微生物叢によって処理されたりすることにより、他の多くの代謝産物シグナルが予想されます。 メタボロミクス分析により、被験者の代謝システムのプロファイルを提供する低分子量化合物に基づいて、次の器官固有および全身プロセスの評価が可能になります: 糖の中間代謝、ミトコンドリアのクエン酸回路、アミノ酸代謝、脂肪の酸化的代謝酸、タンパク質の分解と代謝回転、プリンとピリミジンの代謝、トランスメチル化とトランススルフィドの経路、腸内細菌の代謝。等

PCDAI と医師の全体的な評価は、疾患の活動性を測定するために使用されました。 疾患活動性は 0 ～ 10 のスコアに相当し、軽度の疾患は 11 ～ 30 に相当し、中等度/重度の疾患は 31 以上に相当します。 (10)

ベースライン時および24週目に、患者は回腸結腸鏡検査を受けて、疾患の内視鏡的および組織学的活動を評価します。 回腸結腸鏡検査時に、FISH（蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）を使用して、生検および糞便サンプルの微生物叢の評価を行います。 マルチプレックスアッセイによってすべてのサイトカインおよびケモカインを評価するために、結腸培養を行う。 さらに、生検からの RNA 分析は、プロテアソーム サブユニットまたは他の炎症マーカーの研究のために実行されます。

VSL #3による治療の安全性と忍容性に関する研究中に、追加のデータが収集されます。