En prospektiv, placebokontrollert, dobbeltblind, cross-over-studie på effekten av et probiotisk preparat (VSL#3) på metabolsk profil, intestinal permeabilitet, mikrobiota, cytokiner og kjemokiner og andre inflammatoriske markører hos pediatriske pasienter med Crohns sykdom

Inflammatorisk tarmsykdom (IBD) i barndommen er kronisk tilbakefallende og remitterende betennelsestilstand som har en betydelig innvirkning på vekst og utvikling.

IBD innebærer et skifte fra en regulert tarmimmunrespons til en som er drevet av uhemmet immuncelleaktivering og pro-inflammatorisk cytokinproduksjon. (1) Årsaken til denne økningen i immunstimulering er av stor interesse, og flere studier indikerer en rolle for kommensale bakterier i utviklingen av sykdom. (2) En fersk studie sammenlignet mikrobiotaen til pasienter med IBD med mikrobiotaen til ikke-IBD-kontroller og avslørte en signifikant forskjell i deres sammensetning. Mikrobiotaen til IBD-pasienter viste unormal mikrobiell sammensetning preget av utarming av Firmicutes og Bacteroides, som er representert i ikke-IBD-kontroller. (3)

Forbedret NF-KB-aktivitet er involvert i patologien til begge former for IBD. Crohns sykdom (CD) og ulcerøs kolitt (UC). Mekanismen for proteasommediert NF-KB-aktivering i CD og UC har blitt studert. Visekruna et al demonstrerte at underenhetssammensetningen og den proteolytiske funksjonen til proteasomer er forskjellig mellom UC og CD. Høy ekspresjon av immunproteasom-underenhetene β1i og β2i er karakteristisk for den betente slimhinnen til CD (4). I tråd med dette fant de forbedret prosessering av NF-κB forløper p105 og nedbrytning av hemmer av NF-κB, IκBα, av immunproteasomer isolert fra slimhinnen til CD-pasienter. Sammenlignet med friske kontroller og CD-pasienter, viste UC-pasienter en mellomliggende fenotype angående proteasom-mediert prosessering/nedbrytning av NF-kB-komponenter (4). Til slutt økt ekspresjon av NF-kB-familiemedlemmet c-Rel i den betente slimhinnen av CD-pasienter antyder at p50/c-Rel er viktig for IFN-y-mediert induksjon av immunproteasomer via IL-12-drevne Th1-responser. Disse funnene tyder på at distinkte proteasomunderenheter påvirker intensiteten av NF-KB-mediert betennelse hos IBD-pasienter (4).

I studien til Pagnini C et al., rapporterer forfatterne at den probiotiske blandingen VSL#3 forhindrer utbruddet av tarmbetennelse i SAMP-musemodellen for CD-ileitis. Disse effektene var assosiert med en lokal effekt på tarmepitelet (dvs. stimulering av TNF-α-produksjon og NF-KB-aktivering i epitelceller, kombinert med restitusjon av normal tarmepitelbarrierefunksjon).

Analyse av bakteriell DNA i avføring og ileal slimhinne fra behandlede mus viste en betydelig økning av probiotiske stammer, noe som tyder på at effektiv bakteriell kolonisering er nødvendig for de gunstige effektene av probiotisk behandling. Denne studien støtter hypotesen om at probiotika fremmer tarmhelsen gjennom en mekanisme som involverer stimulering av epiteliale medfødte responser (dvs. stimulering av TNF-α-uttrykk), snarere enn undertrykkelse av betennelse. (5)

Mange individuelle eller kombinasjoner av bakteriearter har vist seg å lindre symptomene på IBD og redusere tarmbetennelse i dyrestudier. Behandling av mus med kolitt med den probiotiske formuleringen VSL#3 økte produksjonen av IL-10 og prosentandelen av TGFβ-uttrykkende T-celler. Overføring av lamina propria mononukleære celler fra VSL#3-behandlede mus forhindret kolitt hos mottakermus, noe som indikerer at VSL#3 kan starte genereringen av en beskyttende populasjon av celler. (6)

Den nylige identifiseringen av symbiotiske bakterier med potente antiinflammatoriske egenskaper, og deres korrelative fravær under sykdom, antyder at visse aspekter av menneskers helse kan avhenge av statusen til mikrobiota. (7)

I tillegg er Lipopolysaccharide (LPS) en hovedkomponent i den bakterielle ytre membranen som i stor grad er ansvarlig for å mediere septisk sjokk. Normalt reagerer ikke kroppen på den høye konsentrasjonen av LPS som finnes i tarmens lumen. Intestinal alkalisk fosfatase (IAP) ser ut til å avgifte LPS ved å hydrolysere den og opprettholde intestinal homeostase med den kommensale floraen. (8)

Probiotika modulerer sammensetningen av tarmmikrobiotaen. Global mikroarray og bioinformatica-analyse avslørte forsterkning av immunrespons, fagocytiske og inflammatoriske veier dominert av økning av Th1-transkripsjonsfaktorer i IL10-KO-mus. IL10-KO-mus administrert oralt med det probiotiske VSL#3 viste en stedsspesifikk nedregulering av disse inflammatoriske veiene inkludert TLR-signalering og relaterte effektorveier som T-celle, B-celle-reseptorsignalering. Enda viktigere, VSL#3 utløste en oppregulering i PPAR-signalering, lipid, nitrogen, aminosyre og xenobiotisk metabolisme (9).

Det er faktisk uklart hvordan VSL#3-induserte endringer i mikrobiell sammensetning påvirker statusen til tarmbetennelse. Det er mulig at VSL#3 fremmer tilstedeværelsen av beskyttende mikroorganismer, sannsynlige bestanddeler av selve probiotikaet som direkte påvirker vertens medfødte responser. Det er rapportert at VSL#3 modulerer barrierefunksjon, intestinal permeabilitet og medfødte vertsfunksjoner, som hvis de endres, kan ha en dyp innvirkning på tilstanden til kolitt. VSL#3 har vist seg å forbedre barrierefunksjonen gjennom redusert epitelpermeabilitet hos IL10_/_ mus, korrelert med en reduksjon i tarmbetennelse. En annen nylig studie viste at VSL#3 forhindrer utviklingen av ileitis hos SAMP1/YitFc-mus ved å forbedre epitelbarrierefunksjonen og aktivere medfødt signalering som fører til NF-jB-aktivering. Disse effektene ser ut til å være mediert av VSL#3-utskilte produkter. Dette er i samsvar med rapporter som viser at probiotika-avledede faktorer er i stand til å modulere vertsresponser og eksperimentell kolitt. I tillegg kan strukturelle komponenter som er tilstede i probiotiske bakterier i stor grad påvirke immunresponsen og favorisere produksjonen av immunsuppressive molekyler som IL-10 (10).

Hensikt:

Formålet med denne studien er å evaluere effekten av en probiotisk formulering, VSL#3, versus placebo, på metabolsk profil, intestinal permeabilitet, mikrobiota, cytokiner og kjemokinekspresjon og andre inflammatoriske markører hos pediatriske pasienter med Crohns sykdom (CD) i remisjon (11).

Sekundære mål er:

• For å bestemme effekten på Pediatric Crohn Disease Activity Index (PCDAI)
• for å bestemme tiden til oppblussing av CD-pediatriske pasienter på VSL#3 sammenlignet med placebo
• for å vurdere om samtidig behandling med VSL#3 reduserer alvorlighetsgraden av en flare hvis den oppstår
• å vurdere sikkerheten og tolerabiliteten av behandling med VSL #3 ved høye doser hos pediatriske pasienter med CD

Studere design

Denne undersøkelsen vil være en randomisert, dobbeltblind, placebokontrollert, cross-over-studie. Studien vil omfatte 30 barn med CD og vil bli artikulert på 6 måneder som følger. En gruppe på 10 frivillige friske barn, sammenlignbare i alder og kjønn, vil bli brukt som referansegruppe for analyse av metabolsk profil.

Disse barna vil bli randomisert til en behandlingsgruppe som i 2 måneder får enten 1-2 pakker som inneholder 900 milliarder bakterier/dag med VSL#3 i henhold til deres vekt, og en gruppe som får placebomedisinen. Tildeling til terapi eller placebo vil bli bestemt i henhold til et datagenerert randomiseringsskjema. Medisinene vil bli utlevert av etterforskeren ved hvert besøk; etterlevelse vil bli vurdert ved å telle returnerte poser og avhøre pasientene. Utmerket etterlevelse vil bli definert som ingen brudd på protokollen med hensyn til inntak av studiemedisinen. Ved avslutningen av de 8 ukene vil det bli utført en "utvaskingsperiode" på 6 uker, da ingen preparat vil bli administrert. Deretter vil hver pasient bli byttet til den andre gruppen og fulgt i ytterligere 8 uker.

Alle pasienter vil fortsette med vanlige medisiner gjennom hele studieperioden (azatioprin assosiert eller ikke til 5-ASA).

Pasientene vil bli vurdert klinisk ved baseline og hver 8. uke frem til fullføring av studien, ved 24 uker eller ved tilbakefallstidspunktet. Ved hvert besøk vil data bli samlet inn, inkludert pasientspørreskjemaer angående sykdomsaktivitet (avføringsfrekvens, avføringskonsistens, hematochezi, magesmerter, ekstraintestinale manifestasjoner av sykdom og generell pasientfunksjon). Ytterligere informasjon samlet inn ved det første besøket inkluderte demografiske data, familiehistorie og symptomdebut. Fysisk undersøkelse vil bli utført ved hvert besøk av en barnelege og inkludert en abdominal undersøkelse og undersøkelse for ekstraintestinale manifestasjoner av CD. Rutinemessige blodprøver for CD, cellobiose/mannitol tynntarmspermeabilitetsstudie, avføringskulturer, avføringskalprotektin, vil bli utført ved hvert besøk og/eller ved tilbakefallstidspunktet. Urin vil bli samlet inn for analyse av metabolsk profil med mono- og todimensjonal høyoppløselig 1H NMR-spektroskopi. Hos 10 friske frivillige barn og pasienter, gallesyre, isoleucin, leucin, valin, 2-okso-3metyl-valerinasyre, 2-okso-isovalerianesyre, 2-metyl-3-hydroksysmørsyre, 3-hydroksybutyrat, 3-hydroksybutyrat, 3-hydroksyisovalerianesyre, treonin, laktat, 3-hydroksimetylglutaminsyre, alanin, N-acetylasparagin + aspartylglutamat + glutamilsyre, eddiksyre, karnitin, aceton, acetoacetat, 2-hydroksiglutarat, pyruvat, etylaktarsyre, glutaminsyre, suksinat, 3-hydroksy-3-metylglukarsyre, dimetylamin, sarkosin, N-acetyl-aspartylglutamat, dimetylglysin, sitronsyre, kreatin, kreatinin, kolin, betain, malonsyre, trimetylaminoksid, sarkosin, glystidin, 1-3-metyl -metylhistidin, benzoilglycin (hippursyre), N-metylbetain (trigonellina), arabinosio, uracil, guanosin, tyrosin, fenylalanin, xantin, hypoksantin, 3-metylhistidin vil bli evaluert. I tillegg, hos barn med CD, vil mange andre metabolitter-signaler forventes, som følge av medikamenter eller andre forbindelser tatt som sådan eller behandlet av kroppens metabolisme eller tarmmikrobielle flora. den metabolomiske analysen vil tillate evaluering av følgende organspesifikke og systemiske prosesser basert på lavmolekylære forbindelser som gir en profil av det metabolske systemet til forsøkspersonene: mellomliggende metabolisme av sukker, mitokondriell sitronsyresyklus, aminosyremetabolisme, oksidativ metabolisme av fett. syre, nedbrytning og omsetning av proteiner, metabolisme av purin og pyrimidin, trans-metyleringsvei og transsulfid, metabolisme av tarmbakterier; etc.

PCDAI og en leges globale vurdering ble brukt til å måle sykdomsaktivitet. Ingen sykdomsaktivitet tilsvarer en skår på 0-10, mild sykdom tilsvarer 11-30, moderat/alvorlig sykdom tilsvarer 31 eller mer. (10)

Ved baseline og ved 24 uker vil pasientene gjennomgå ileokolonoskopi for å evaluere sykdommens endoskopiske og histologiske aktivitet. Evaluering av mikrobiota på biopsier og avføringsprøver vil bli utført på tidspunktet for ileokolonoskopier ved bruk av FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). En kolonkultur vil bli utført for å evaluere alle cytokiner og kjemokiner ved multipleksanalyse. I tillegg vil RNA-analysen fra biopsier bli utført for studiet av proteasomunderenheter eller andre inflammatoriske markører

Ytterligere data vil bli samlet inn i løpet av studien angående sikkerhet og tolerabilitet ved behandling med VSL #3.