Tuleva, lumekontrolloitu, kaksoissokkoutettu, ristikkäinen tutkimus probioottisen valmisteen (VSL#3) vaikutuksista aineenvaihduntaprofiiliin, suoliston läpäisevyyteen, mikrobiotaan, sytokiinien ja kemokiinien ilmentymiseen ja muihin tulehdusmarkkereihin Crohnin tautia sairastavilla lapsipotilailla

Lapsuuden tulehduksellinen suolistosairaus (IBD) on krooninen uusiutuva ja remittoiva tulehdustila, jolla on merkittävä vaikutus kasvuun ja kehitykseen.

IBD sisältää siirtymisen säädellystä suoliston immuunivasteesta sellaiseen, jota ohjaa hillitön immuunisolujen aktivaatio ja tulehdusta edistävä sytokiinituotanto. (1) Tämän immuunistimulaation lisääntymisen syy on erittäin kiinnostava, ja useat tutkimukset osoittavat kommensaalibakteerien roolin taudin etenemisessä. (2) Äskettäisessä tutkimuksessa verrattiin IBD-potilaiden mikrobiotaa ei-IBD-kontrollien mikrobiottiin ja paljasti merkittävän eron niiden koostumuksessa. IBD-potilaiden mikrobiota osoitti epänormaalia mikrobikoostumusta, jolle oli tunnusomaista Firmicutes- ja Bacteroides-bakteerien väheneminen, jotka ovat edustettuina ei-IBD-kontrollissa. (3)

Tehostunut NF-KB-aktiivisuus liittyy molempien IBD-muotojen patologiaan. Crohnin tauti (CD) ja haavainen paksusuolitulehdus (UC). Proteasomivälitteisen NF-KB-aktivaation mekanismia CD:ssä ja UC:ssa on tutkittu. Visekruna et ai. osoittivat, että alayksikkökoostumus ja proteasomien proteolyyttinen toiminta eroavat UC:n ja CD:n välillä. Immunoproteasomin alayksiköiden β1i ja β2i korkea ilmentyminen on ominaista CD:n tulehtuneelle limakalvolle (4). Tämän mukaisesti he havaitsivat CD-potilaiden limakalvolta eristettyjen immunoproteasomien vaikutuksesta NF-KB-prekursorin p105:n tehostuneen prosessoinnin ja NF-KB:n inhibiittorin IkBα:n hajoamisen. Verrattuna terveisiin kontrolleihin ja CD-potilaisiin, UC-potilailla oli keskitasoinen fenotyyppi koskien NF-KB-komponenttien proteasomivälitteistä prosessointia/hajoamista (4). Lopuksi NF-kB-perheen jäsenen c-Rel lisääntyi tulehtuneessa limakalvossa. CD-potilaista viittaa siihen, että p50/c-Rel on tärkeä IFN-y-välitteiselle immunoproteasomien induktiolle IL-12-ohjattujen Th1-vasteiden kautta. Nämä havainnot viittaavat siihen, että erilliset proteasomialayksiköt vaikuttavat NF-KB-välitteisen tulehduksen voimakkuuteen IBD-potilailla (4).

Pagnini C:n et al.:n tutkimuksessa kirjoittajat raportoivat, että probioottiseos VSL#3 estää suoliston tulehduksen puhkeamisen CD-ileiitin SAMP-hiirimallissa. Nämä vaikutukset liittyivät paikalliseen vaikutukseen suoliston epiteeliin (eli TNF-a:n tuotannon stimulaatioon ja NF-KB:n aktivaatioon epiteelisoluissa yhdistettynä normaalin suolen epiteelin estetoiminnan palautumiseen).

Bakteeri-DNA:n analyysi hoidettujen hiirten ulosteesta ja sykkyräsuolen limakalvosta osoitti probioottikantojen merkittävän lisääntymisen, mikä viittaa siihen, että probioottihoidon hyödylliset vaikutukset edellyttävät tehokasta bakteerikolonisaatiota. Tämä tutkimus tukee hypoteesia, että probiootit edistävät suoliston terveyttä mekanismin kautta, joka sisältää epiteelin synnynnäisten vasteiden stimuloinnin (eli TNF-α:n ilmentymisen stimuloinnin) tulehduksen tukahduttamisen sijaan. (5)

Eläinkokeissa on osoitettu, että monet yksittäiset bakteerilajit tai yhdistelmät lievittävät IBD:n oireita ja vähentävät suolistotulehdusta. Hiirten, joilla oli paksusuolentulehdus, hoito probioottiformulaatiolla VSL#3 lisäsi IL-10:n tuotantoa ja TGFp-proteiinia ilmentävien T-solujen prosenttiosuutta. Lamina propria mononukleaaristen solujen siirto VSL#3:lla käsitellyistä hiiristä esti koliittia vastaanottajahiirillä, mikä osoittaa, että VSL#3 voi aloittaa suojaavan solupopulaation muodostumisen. (6)

Äskettäin havaittu symbioottisten bakteerien, joilla on voimakkaita anti-inflammatorisia ominaisuuksia, ja niiden korrelaatio poissaolo sairauden aikana, viittaa siihen, että tietyt ihmisten terveyden näkökohdat voivat riippua mikrobiotan tilasta. (7)

Lisäksi lipopolysakkaridi (LPS) on bakteerien ulkokalvon pääkomponentti, joka on suurelta osin vastuussa septisen shokin välittämisestä. Normaalisti elimistö ei reagoi suureen LPS-pitoisuuteen, joka on läsnä suolen ontelossa. Suolen alkalinen fosfataasi (IAP) näyttää puhdistavan LPS:n myrkkyjä hydrolysoimalla sitä ja ylläpitämällä suoliston homeostaasia kommensaaliflooran kanssa. (8)

Probiootit muokkaavat suoliston mikrobiston koostumusta. Globaali microarray- ja bioinformatica-analyysi paljasti immuunivasteen, fagosyyttisten ja tulehdusreittien lisääntymisen, joita hallitsee Th1-transkriptiotekijöiden nousu IL10-KO-hiirissä. IL10-KO-hiiret, joille annettiin oraalisesti probioottia VSL#3, osoittivat näiden tulehdusreittien paikkaspesifistä säätelyä, mukaan lukien TLR-signalointi ja siihen liittyvät efektorireitit, kuten T-solu-, B-solureseptorisignalointi. Vielä tärkeämpää on, että VSL#3 laukaisi PPAR-signaloinnin, lipidien, typen, aminohappojen ja ksenobioottisen aineenvaihdunnan lisääntymisen (9).

Itse asiassa on epäselvää, kuinka VSL#3:n aiheuttamat muutokset mikrobikoostumuksessa vaikuttavat suoliston tulehduksen tilaan. On mahdollista, että VSL#3 edistää suojaavien mikro-organismien läsnäoloa, jotka ovat itse probiootin todennäköisiä aineosia, jotka vaikuttavat suoraan isännän synnynnäisiin vasteisiin. On raportoitu, että VSL#3 moduloi estetoimintoa, suoliston läpäisevyyttä ja synnynnäisiä isäntätoimintoja, joilla voi olla syvällinen vaikutus paksusuolentulehduksen tilaan, jos niitä muutetaan. VSL#3:n on osoitettu tehostavan estetoimintoa vähentämällä epiteelin läpäisevyyttä IL10_/_-hiirillä, mikä korreloi suoliston tulehduksen vähenemisen kanssa. Toinen äskettäinen tutkimus osoitti, että VSL#3 estää ileiitin kehittymistä SAMP1/YitFc-hiirissä tehostamalla epiteelin estetoimintoa ja aktivoimalla synnynnäistä signalointia, mikä johtaa NF-jB:n aktivaatioon. Nämä vaikutukset näyttävät olevan VSL#3:n erittämien tuotteiden välittämiä. Tämä on yhdenmukainen raporttien kanssa, jotka osoittavat, että probioottiperäiset tekijät pystyvät moduloimaan isännän vasteita ja kokeellista paksusuolentulehdusta. Lisäksi probioottisten bakteerien rakenteelliset komponentit voivat vaikuttaa syvästi immuunivasteeseen ja edistää immunosuppressiivisten molekyylien, kuten IL-10:n, tuotantoa (10).

Tarkoitus:

Tämän tutkimuksen tarkoituksena on arvioida probioottiformulaation, VSL#3, ja lumelääkkeen vaikutusta metaboliseen profiiliin, suoliston läpäisevyyteen, mikrobiotaan, sytokiinien ja kemokiinien ilmentymiseen ja muihin tulehdusmarkkereihin lapsipotilailla, joilla on Crohnin tauti (CD) remissiossa. (11).

Toissijaiset tavoitteet ovat:

• Vaikutuksen määrittäminen lasten Crohnin taudin aktiivisuusindeksiin (PCDAI)
• VSL#3-potilaiden CD-potilaiden taudin puhkeamiseen kuluvan ajan määrittämiseksi lumelääkkeeseen verrattuna
• arvioida, vähentääkö samanaikainen hoito VSL#3:n kanssa pahenemisen vakavuutta, jos sitä esiintyy
• arvioida VSL #3 -hoidon turvallisuutta ja siedettävyyttä suurilla annoksilla lapsipotilailla, joilla on CD

Opintojen suunnittelu

Tämä tutkimus on satunnaistettu, kaksoissokkoutettu, lumekontrolloitu, ristikkäinen tutkimus. Tutkimukseen osallistuu 30 CD:tä sairastavaa lasta, ja se artikuloidaan 6 kuukauden kuluttua seuraavasti. Vertailuryhmänä aineenvaihduntaprofiilin analysoinnissa käytetään 10 vapaaehtoisen terveen lapsen ryhmää, jotka ovat iältään ja sukupuoliltaan vertailukelpoisia.

Nämä lapset satunnaistetaan hoitoryhmään, joka saa 2 kuukauden ajan joko 1-2 pakettia, joka sisältää 900 miljardia VSL#3-bakteeria päivässä, ja ryhmään, joka saa lumelääkettä. Hoitoon tai lumelääkkeeseen kohdistaminen määritetään tietokoneella luodun satunnaistuksen mukaan. Tutkija jakaa lääkkeet jokaisella käynnillä; noudattaminen arvioidaan laskemalla palautetut pussit ja kuulustelemalla potilaita. Erinomaisena hoitomyöntyvyytenä määritellään, että tutkimuslääkkeen ottamista koskevaa protokollaa ei rikota. 8 viikon päätyttyä suoritetaan 6 viikon "wash-out"-jakso, jolloin valmistetta ei anneta. Sitten jokainen potilas siirretään toiseen ryhmään ja häntä seurataan samoin vielä 8 viikkoa.

Kaikki potilaat jatkavat säännöllistä lääkitystä koko tutkimusjakson ajan (atsatiopriinin yhteydessä tai ei 5-ASA:ssa).

Potilaat arvioidaan kliinisesti lähtötilanteessa ja joka 8. viikko tutkimuksen päättymiseen saakka, 24 viikon kohdalla tai taudin uusiutumisen yhteydessä. Jokaisella käynnillä kerätään tietoja, mukaan lukien potilaskyselyt sairauden aktiivisuudesta (ulosteiden tiheys, ulosteen konsistenssi, hematokeesia, vatsakipu, taudin suoliston ulkopuoliset ilmenemismuodot ja potilaan yleinen toiminta). Ensimmäisellä käynnillä kerättyihin lisätietoihin kuuluivat väestötiedot, sukuhistoria ja oireiden alkaminen. Lastenlääkäri suorittaa jokaisella käynnillä fyysisen tutkimuksen, joka sisältää vatsan tutkimuksen ja CD:n suoliston ulkopuolisten ilmenemismuotojen tutkimuksen. Rutiininomaiset verikokeet CD:n varalta, sellobioosi/mannitoli ohutsuolen läpäisevyystutkimus, ulosteviljelmät, ulosteen kalprotektiini, tehdään jokaisella käynnillä ja/tai taudin uusiutumisen yhteydessä. Virtsa kerätään metabolisen profiilin analysointia varten yksi- ja kaksiulotteisella korkean erotuskyvyn 1H NMR-spektroskopialla. 10 terveellä vapaaehtoisella lapsella ja potilaalla sappihappoa, isoleusiinia, leusiinia, valiinia, 2-okso-3-metyylivaleriaanahappoa, 2-okso-isovaleriinihappoa, 2-metyyli-3-hydroksivoihappoa, 3-hydroksibutyraattia, 3-hydroksibutyraattia, 3-hydroksi-isovaleriinihappo, treoniini, laktaatti, 3-hydroksimetyyliglutamiinihappo, alaniini, N-asetyyliasparagiini + aspartyyliglutamaatti + glutamiilihappo, etikkahappo, karnitiini, asetoni, asetoasetaatti, 2-hydroksiglutaraatti, pyruvaatti, N-glutamiinihappo, glutamiinihappo, pyruvaatti sukkinaatti, 3-hydroksi-3-metyyliglukarihappo, dimetyyliamiini, sarkosiini, N-asetyyliaspartyyliglutamaatti, dimetyyliglysiini, sitruunahappo, kreatiini, kreatiniini, koliini, betaiini, malonihappo, trimetyyliamiinioksidi, sarkosiini, glysiini, 1-metyylihistidiini, 3 -metyylihistidiini, bentsoiglysiini (hippurihappo), N-metyylibetaiini (trigonellina), arabinosio, urasiili, guanosiini, tyrosiini, fenyylialaniini, ksantiini, hypoksantiini, 3-metyylihistidiini. Lisäksi CD:tä sairastavilla lapsilla odotetaan monia muita metaboliittisignaaleja, jotka johtuvat sellaisista lääkkeistä tai muista yhdisteistä, joita kehon aineenvaihdunta tai suoliston mikrobifloora käsittelee. metabolominen analyysi mahdollistaa seuraavien pienimolekyylipainoisiin yhdisteisiin perustuvien elinspesifisten ja systeemisten prosessien arvioinnin, joka antaa profiilin koehenkilöiden aineenvaihduntajärjestelmästä: sokerin väliaineenvaihdunta, mitokondrioiden sitruunahappokierto, aminohappojen aineenvaihdunta, rasvan oksidatiivinen aineenvaihdunta happo, proteiinien hajoaminen ja vaihtuvuus, puriinin ja pyrimidiinin aineenvaihdunta, transmetylaatio- ja trans-sulfidireitti, suolistobakteerien aineenvaihdunta; jne.

Taudin aktiivisuuden mittaamiseen käytettiin PCDAI:ta ja lääkärin yleisarviointia. Mikään taudin aktiivisuus ei vastaa arvoa 0–10, lievä sairaus on 11–30, keskivaikea/vaikea sairaus 31 tai enemmän. (10)

Potilaille tehdään lähtötilanteessa ja viikolla 24 ileokolonoskopia taudin endoskooppisen ja histologisen aktiivisuuden arvioimiseksi. Mikrobiootan arviointi biopsioista ja ulostenäytteistä suoritetaan ileokolonoskopioiden yhteydessä FISH-menetelmällä (fluorescence In Situ Hybridization). Suoritetaan paksusuolenviljely kaikkien sytokiinien ja kemokiinien arvioimiseksi multipleksimäärityksellä. Lisäksi biopsioista saatu RNA-analyysi suoritetaan proteasomien alayksiköiden tai muiden tulehdusmerkkiaineiden tutkimiseksi.

Tutkimuksen aikana kerätään lisätietoja VSL #3 -hoidon turvallisuudesta ja siedettävyydestä.