Um estudo prospectivo, controlado por placebo, duplo-cego, cruzado sobre os efeitos de uma preparação probiótica (VSL#3) no perfil metabólico, permeabilidade intestinal, microbiota, expressão de citocinas e quimiocinas e outros marcadores inflamatórios em pacientes pediátricos com doença de Crohn

As Doenças Inflamatórias Intestinais (DII) na infância são condições inflamatórias crônicas recidivantes e remitentes que têm um impacto significativo no crescimento e desenvolvimento.

A DII envolve uma mudança de uma resposta imune intestinal regulada para outra que é impulsionada pela ativação desenfreada de células imunes e produção de citocinas pró-inflamatórias. (1) A causa desse aumento na estimulação imune é de grande interesse e vários estudos indicam um papel das bactérias comensais na progressão da doença. (2) Um estudo recente comparou a microbiota de pacientes com DII com a de controles sem DII e revelou uma diferença significativa em sua composição. A microbiota de pacientes com DII mostrou composição microbiana anormal caracterizada pela depleção de Firmicutes e Bacteroides, que estão representados em controles não-DII. (3)

A atividade aumentada de NF-κB está envolvida na patologia de ambas as formas de IBD. doença de Crohn (DC) e colite ulcerativa (CU). O mecanismo de ativação de NF-κB mediado por proteassoma em DC e UC foi estudado. Visekruna et al demonstraram que a composição da subunidade e a função proteolítica dos proteassomas diferem entre UC e CD. A alta expressão das subunidades β1i e β2i do imunoproteassoma é característica da mucosa inflamada da DC (4). Em consonância com isso, eles encontraram processamento aprimorado do precursor NF-κB p105 e degradação do inibidor de NF-κB, IκBα, por imunoproteassomas isolados da mucosa de pacientes com DC. Em comparação com controles saudáveis ​​e pacientes com DC, os pacientes com UC exibiram um fenótipo intermediário em relação ao processamento/degradação mediado por proteassoma dos componentes do NF-κB (4). de pacientes com DC sugere que p50/c-Rel é importante para a indução de imunoproteassomas mediada por IFN-γ por meio de respostas Th1 dirigidas por IL-12. Esses achados sugerem que subunidades distintas de proteassoma influenciam a intensidade da inflamação mediada por NF-κB em pacientes com DII (4).

No estudo de Pagnini C et al., os autores relatam que a mistura probiótica VSL#3 previne o aparecimento de inflamação intestinal no modelo SAMP de CD-ileíte. Esses efeitos foram associados a um efeito local no epitélio intestinal (ou seja, estimulação da produção de TNF-α e ativação de NF-κB em células epiteliais, juntamente com a restituição da função de barreira epitelial intestinal normal).

A análise do DNA bacteriano nas fezes e na mucosa ileal de camundongos tratados demonstrou um aumento significativo de cepas probióticas, sugerindo que a colonização bacteriana efetiva é necessária para os efeitos benéficos do tratamento probiótico. Este estudo apóia a hipótese de que os probióticos promovem a saúde intestinal por meio de um mecanismo que envolve a estimulação de respostas inatas epiteliais (ou seja, estimulação da expressão de TNF-α), em vez da supressão da inflamação. (5)

Muitos indivíduos ou combinações de espécies bacterianas demonstraram melhorar os sintomas da DII e reduzir a inflamação intestinal em estudos com animais. O tratamento de camundongos com colite com a formulação probiótica VSL#3 aumentou a produção de IL-10 e a porcentagem de células T que expressam TGFβ. A transferência de células mononucleares da lâmina própria de camundongos tratados com VSL#3 impediu a colite em camundongos receptores, indicando que o VSL#3 pode iniciar a geração de uma população protetora de células. (6)

A recente identificação de bactérias simbióticas com propriedades anti-inflamatórias potentes e sua ausência correlata durante a doença sugere que certos aspectos da saúde humana podem depender do estado da microbiota. (7)

Além disso, o lipopolissacarídeo (LPS) é um componente importante da membrana externa bacteriana que é amplamente responsável pela mediação do choque séptico. Normalmente o corpo não reage à alta concentração de LPS que está presente no lúmen intestinal. A fosfatase alcalina intestinal (IAP) parece desintoxicar o LPS, hidrolisando-o e mantendo a homeostase intestinal com a flora comensal. (8)

Os probióticos modulam a composição da microbiota intestinal. A análise global de microarray e bioinformática revelou aumento da resposta imune, vias fagocíticas e inflamatórias dominadas pela elevação de fatores de transcrição Th1 em camundongos IL10-KO. Camundongos IL10-KO administrados por via oral com o probiótico VSL # 3 exibiram uma regulação negativa específica do local dessas vias inflamatórias, incluindo sinalização de TLR e vias efetoras relacionadas, como sinalização de receptor de célula T e célula B. Mais importante, VSL #3 desencadeou uma regulação positiva na sinalização de PPAR, lipídios, nitrogênio, aminoácidos e metabolismo xenobiótico (9).

Na verdade, não está claro como as mudanças induzidas por VSL#3 na composição microbiana afetam o estado da inflamação intestinal. É possível que o VSL#3 promova a presença de microrganismos protetores, prováveis ​​constituintes do próprio probiótico que influenciam diretamente as respostas inatas do hospedeiro. Foi relatado que o VSL#3 modula a função de barreira, a permeabilidade intestinal e as funções inatas do hospedeiro, que, se alteradas, podem ter um impacto profundo no estado de colite. Foi demonstrado que o VSL#3 aumenta a função de barreira por meio da diminuição da permeabilidade epitelial em camundongos IL10_/_, correlacionando-se com uma redução na inflamação intestinal. Outro estudo recente demonstrou que o VSL#3 previne o desenvolvimento de ileíte em camundongos SAMP1/YitFc ao aumentar a função da barreira epitelial e ativar a sinalização inata levando à ativação do NF-jB. Esses efeitos parecem ser mediados pelos produtos secretados pelo VSL#3. Isso é consistente com relatórios que mostram que os fatores derivados de probióticos são capazes de modular as respostas do hospedeiro e a colite experimental. Além disso, os componentes estruturais presentes nas bactérias probióticas podem impactar profundamente a resposta imune e favorecer a produção de moléculas imunossupressoras como a IL-10 (10).

Propósito:

O objetivo deste estudo é avaliar o efeito de uma formulação probiótica, VSL#3, versus placebo, no perfil metabólico, permeabilidade intestinal, microbiota, expressão de citocinas e quimiocinas e outros marcadores inflamatórios em pacientes pediátricos com Doença de Crohn (DC) em remissão (11).

Os objetivos secundários são:

• Para determinar o efeito no Índice de Atividade da Doença de Crohn Pediátrica (PCDAI)
• para determinar o tempo até o surto de pacientes pediátricos com DC em VSL # 3 em comparação com placebo
• para avaliar se a terapia concomitante com VSL#3 reduz a gravidade de uma exacerbação se ela ocorrer
• avaliar a segurança e tolerabilidade da terapia com VSL #3 em alta dosagem em pacientes pediátricos com DC

Design de estudo

Esta investigação será um estudo randomizado, duplo-cego, controlado por placebo e cruzado. O estudo incluirá 30 crianças com DC e será articulado em 6 meses da seguinte forma. Um grupo de 10 crianças saudáveis ​​voluntárias, comparáveis ​​em idade e sexo, será utilizado como grupo de referência para a análise do perfil metabólico.

Essas crianças serão randomizadas para um grupo de tratamento recebendo por 2 meses 1-2 pacotes contendo 900 bilhões de bactérias/dia de VSL#3 de acordo com seu peso, e um grupo recebendo o medicamento placebo. A atribuição de terapia ou placebo será determinada de acordo com um esquema de randomização gerado por computador. Os medicamentos serão dispensados ​​pelo investigador a cada visita; a adesão será avaliada contando as bolsas devolvidas e questionando os pacientes. A adesão excelente será definida como nenhuma violação do protocolo com relação à ingestão da medicação do estudo. Ao completar as 8 semanas, será feito um período de "wash-out" de 6 semanas, quando nenhuma preparação será administrada. Em seguida, cada paciente será transferido para o outro grupo e acompanhado da mesma forma por mais 8 semanas.

Todos os pacientes continuarão com a medicação regular durante todo o período do estudo (azatioprina associada ou não ao 5-ASA).

Os pacientes serão avaliados clinicamente no início e a cada 8 semanas até a conclusão do estudo, em 24 semanas ou no momento da recaída. Em cada visita, os dados serão coletados, incluindo questionários do paciente sobre a atividade da doença (frequência das fezes, consistência das fezes, hematoquezia, dor abdominal, manifestações extraintestinais da doença e funcionamento geral do paciente). Informações adicionais coletadas na primeira visita incluíram dados demográficos, histórico familiar e início dos sintomas. O exame físico será realizado em cada visita por um pediatra e incluirá um exame abdominal e exame para manifestações extraintestinais de DC. Exames de sangue de rotina para DC, estudo de permeabilidade do intestino delgado celobiose/manitol, culturas de fezes, calprotectina fecal, serão realizados em todas as visitas e/ou no momento da recaída. A urina será coletada para análise do perfil metabólico com espectroscopia de RMN de 1H mono e bidimensional de alta resolução. Em 10 crianças e pacientes voluntários saudáveis, ácido biliar, isoleucina, leucina, valina, ácido 2-oxo-3metil-valérico, ácido 2-oxo-isovalérico, ácido 2-metil-3-hidroxibutírico, 3-hidroxibutirato, 3-hidroxibutirato, ácido 3-hidroxiisovalérico, treonina, lactato, ácido 3-hidroximetilglutâmico, alanina, N-acetil asparagina + glutamato aspartil + ácido glutamil, ácido acético, carnitina, acetona, acetoacetato, 2-hidroxiglutarato, piruvato, ácido glutárico, ácido N-acetilglutâmico, succinato, ácido 3-hidroxi-3-metilglucárico, dimetilamina, sarcosina, N-acetil-aspartil-glutamato, dimetilglicina, ácido cítrico, creatina, creatinina, colina, betaína, ácido malônico, trimetilaminoóxido, sarcosina, glicina, 1-metil-histidina, 3 Serão avaliados -metilhistidina, benzoilglicina (ácido hipúrico), N-metil betaína (trigonelina), arabinosio, uracil, guanosina, tirosina, fenilalanina, xantina, hipoxantina, 3-metilhistidina. Além disso, em crianças com DC, muitos outros sinais de metabólitos serão esperados, resultantes de drogas ou outros compostos tomados como tal ou processados ​​pelo metabolismo do corpo ou pela flora microbiana intestinal. a análise metabolômica permitirá avaliar os seguintes processos organoespecíficos e sistêmicos baseados em compostos de baixo peso molecular fornecendo um perfil do sistema metabólico dos sujeitos: metabolismo intermediário do açúcar, ciclo mitocondrial do ácido cítrico, metabolismo dos aminoácidos, metabolismo oxidativo dos ácido, quebra e renovação de proteínas, metabolismo de purina e pirimidina, via de transmetilação e transsulfeto, metabolismo de bactérias intestinais; etc.

O PCDAI e a avaliação global de um médico foram usados ​​para medir a atividade da doença. Nenhuma atividade da doença é igual a uma pontuação de 0-10, doença leve é ​​igual a 11-30, doença moderada/grave é igual a 31 ou mais. (10)

No início e em 24 semanas, os pacientes serão submetidos a ileocolonoscopia para avaliar a atividade endoscópica e histológica da doença. A avaliação da microbiota em biópsias e amostras de fezes será realizada no momento das ileocolonoscopias usando FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). Uma cultura de cólon será realizada para avaliar todas as citocinas e quimiocinas por ensaio multiplex. Além disso, a análise de RNA de biópsias será realizada para o estudo de subunidades de proteassoma ou outros marcadores inflamatórios

Dados adicionais serão coletados durante o estudo em relação à segurança e tolerabilidade da terapia com VSL #3.