Prospektivní, placebem kontrolovaná, dvojitě zaslepená, zkřížená studie o účincích probiotického přípravku (VSL#3) na metabolický profil, intestinální permeabilitu, mikrobiotu, expresi cytokinů a chemokinů a další zánětlivé markery u dětských pacientů s Crohnovou chorobou

Inflammatory Bowel Disease (IBD) v dětství jsou chronické recidivující a remitující zánětlivé stavy, které mají významný dopad na růst a vývoj.

IBD zahrnuje posun od regulované střevní imunitní reakce k reakci, která je řízena neomezenou aktivací imunitních buněk a prozánětlivou produkcí cytokinů. (1) Příčina tohoto zvýšení imunitní stimulace je velmi zajímavá a několik studií naznačuje roli komenzálních bakterií v progresi onemocnění. (2) Nedávná studie porovnávala mikrobiotu pacientů s IBD s mikroflórou kontrol bez IBD a odhalila významný rozdíl v jejich složení. Mikrobiota pacientů s IBD vykazovala abnormální mikrobiální složení charakterizované deplecí Firmicutes a Bacteroides, které jsou zastoupeny v kontrolách bez IBD. (3)

Zvýšená aktivita NF-KB se podílí na patologii obou forem IBD. Crohnova choroba (CD) a ulcerózní kolitida (UC). Byl studován mechanismus proteazomem zprostředkované aktivace NF-KB u CD a UC. Visekruna et al prokázali, že složení podjednotek a proteolytická funkce proteazomů se mezi UC a CD liší. Vysoká exprese imunoproteazomových podjednotek β1i a β2i je charakteristická pro zanícenou sliznici CD (4). V souladu s tím zjistili zvýšené zpracování NF-κB prekurzoru p105 a degradaci inhibitoru NF-κB, IκBα, imunoproteazomy izolovanými ze sliznice pacientů s CD. Ve srovnání se zdravými kontrolami a pacienty s CD vykazovali pacienti s UC intermediární fenotyp týkající se proteazomem zprostředkovaného zpracování/degradace složek NF-κB (4) . Konečně zvýšená exprese člena rodiny NF-κB c-Rel v zanícené sliznici CD pacientů naznačuje, že p50/c-Rel je důležitý pro IFN-y-zprostředkovanou indukci imunoproteazomů prostřednictvím IL-12-řízených Th1 odpovědí. Tato zjištění naznačují, že odlišné proteazomové podjednotky ovlivňují intenzitu zánětu zprostředkovaného NF-κB u pacientů s IBD (4).

Ve studii Pagnini C et al. autoři uvádějí, že probiotická směs VSL#3 zabraňuje vzniku střevního zánětu u myšího modelu SAMP CD-ileitidy. Tyto účinky byly spojeny s lokálním účinkem na střevní epitel (tj. stimulace produkce TNF-a a aktivace NF-KB v epiteliálních buňkách, spojená s obnovením normální funkce střevní epiteliální bariéry).

Analýza bakteriální DNA ve stolici a ileální sliznici léčených myší prokázala významný nárůst probiotických kmenů, což naznačuje, že pro příznivé účinky probiotické léčby je nutná účinná bakteriální kolonizace. Tato studie podporuje hypotézu, že probiotika podporují zdraví střev prostřednictvím mechanismu zahrnujícího stimulaci vrozených epiteliálních odpovědí (tj. stimulaci exprese TNF-a), spíše než potlačení zánětu. (5)

Ve studiích na zvířatech bylo prokázáno, že mnoho jednotlivců nebo kombinací bakteriálních druhů zlepšuje symptomy IBD a snižuje zánět střev. Léčba myší s kolitidou probiotickou formulací VSL#3 zvýšila produkci IL-10 a procento T-buněk exprimujících TGFp. Přenos mononukleárních buněk lamina propria z myší ošetřených VSL#3 zabránil kolitidě u recipientních myší, což ukazuje, že VSL#3 může iniciovat tvorbu ochranné populace buněk. (6)

Nedávná identifikace symbiotických bakterií se silnými protizánětlivými vlastnostmi a jejich korelativní nepřítomnost během onemocnění naznačuje, že určité aspekty lidského zdraví mohou záviset na stavu mikrobioty. (7)

Kromě toho je lipopolysacharid (LPS) hlavní složkou bakteriální vnější membrány, která je z velké části zodpovědná za zprostředkování septického šoku. Normálně tělo nereaguje na vysokou koncentraci LPS, která je přítomna ve střevním lumen. Zdá se, že střevní alkalická fosfatáza (IAP) detoxikuje LPS tím, že jej hydrolyzuje a udržuje střevní homeostázu s komenzální flórou. (8)

Probiotika upravují složení střevní mikroflóry. Globální mikročipová a bioinformatická analýza odhalila augmentaci imunitní odpovědi, fagocytární a zánětlivé dráhy, kterým dominuje zvýšení transkripčních faktorů Th1 u IL10-KO myší. Myši IL10-KO, kterým bylo orálně podáváno probiotikum VSL#3, vykazovaly místně specifickou downregulaci těchto zánětlivých drah včetně signalizace TLR a souvisejících efektorových drah, jako je signalizace T-buněk a receptorů B-buněk. Důležitější je, že VSL#3 spustil up-regulaci v PPAR signalizaci, metabolismu lipidů, dusíku, aminokyselin a xenobiotik (9).

Ve skutečnosti není jasné, jak změny mikrobiálního složení vyvolané VSL#3 ovlivňují stav střevního zánětu. Je možné, že VSL#3 podporuje přítomnost ochranných mikroorganismů, pravděpodobných složek samotného probiotika, které přímo ovlivňují vrozené reakce hostitele. Bylo hlášeno, že VSL#3 moduluje bariérovou funkci, střevní permeabilitu a vrozené funkce hostitele, které, pokud by byly změněny, by mohly mít hluboký dopad na stav kolitidy. Ukázalo se, že VSL#3 zvyšuje bariérovou funkci prostřednictvím snížené permeability epitelu u IL10_/_ myší, což koreluje se snížením zánětu střev. Další nedávná studie prokázala, že VSL#3 zabraňuje rozvoji ileitidy u myší SAMP1/YitFc posílením funkce epiteliální bariéry a aktivací vrozené signalizace vedoucí k aktivaci NF-jB. Zdá se, že tyto účinky jsou zprostředkovány secernovanými produkty VSL#3. To je v souladu se zprávami, které ukazují, že faktory odvozené od probiotik jsou schopné modulovat reakce hostitele a experimentální kolitidu. Strukturální složky přítomné v probiotických bakteriích by navíc mohly výrazně ovlivnit imunitní odpověď a podpořit produkci imunosupresivních molekul, jako je IL-10 (10).

Účel:

Účelem této studie je vyhodnotit účinek probiotické formulace VSL#3 oproti placebu na metabolický profil, střevní permeabilitu, mikrobiotu, expresi cytokinů a chemokinů a další zánětlivé markery u dětských pacientů s Crohnovou chorobou (CD) v remisi (11).

Sekundární cíle jsou:

• Určení účinku na index aktivity dětské Crohnovy choroby (PCDAI)
• ke stanovení doby do vzplanutí CD u pediatrických pacientů na VSL#3 ve srovnání s placebem
• k posouzení, zda souběžná terapie s VSL#3 snižuje závažnost vzplanutí, pokud k němu dojde
• k posouzení bezpečnosti a snášenlivosti léčby VSL #3 ve vysokých dávkách u pediatrických pacientů s CD

Studovat design

Toto šetření bude randomizovaná, dvojitě zaslepená, placebem kontrolovaná, zkřížená studie. Studie bude zahrnovat 30 dětí s CD a bude artikulována za 6 měsíců následovně. Skupina 10 zdravých dětí dobrovolníků, srovnatelných věkem a pohlavím, bude použita jako referenční skupina pro analýzu metabolického profilu.

Tyto děti budou randomizovány do léčebné skupiny, která bude dostávat po dobu 2 měsíců buď 1-2 balíčky obsahující 900 miliard bakterií/den VSL#3 podle jejich hmotnosti, a do skupiny, která bude dostávat placebo. Přiřazení k terapii nebo placebu bude určeno podle počítačem generovaného randomizačního schématu. Léky budou vydávány zkoušejícím při každé návštěvě; dodržování bude hodnoceno spočítáním vrácených tašek a dotazováním pacientů. Vynikající compliance bude definována jako žádné porušení protokolu s ohledem na příjem studované medikace. Po dokončení 8 týdnů bude provedeno „vymývací“ období 6 týdnů, kdy nebude podáván žádný přípravek. Poté bude každý pacient převeden do druhé skupiny a sledován podobně po dobu dalších 8 týdnů.

Všichni pacienti budou pokračovat v pravidelné medikaci po celou dobu studie (azathioprin spojený s 5-ASA nebo ne).

Pacienti budou klinicky hodnoceni na začátku a každých 8 týdnů až do dokončení studie, ve 24. týdnu nebo v době relapsu. Při každé návštěvě budou shromažďovány údaje včetně pacientských dotazníků týkající se aktivity onemocnění (frekvence stolice, konzistence stolice, hematochezie, bolesti břicha, extraintestinální projevy onemocnění a celkové fungování pacienta). Další informace shromážděné při první návštěvě zahrnovaly demografické údaje, rodinnou anamnézu a nástup příznaků. Fyzikální vyšetření bude prováděno při každé návštěvě pediatrem a zahrnovalo vyšetření břicha a vyšetření mimostřevních projevů CD. Při každé návštěvě a/nebo v době relapsu budou prováděny rutinní krevní testy na CD, studie propustnosti tenkého střeva celobióza/mannitol, kultivace stolice, kalprotektin stolice. Moč bude odebírána pro analýzu metabolického profilu pomocí mono a dvourozměrné 1H NMR spektroskopie s vysokým rozlišením. U 10 zdravých dobrovolníků a pacientů byly žlučové kyseliny, isoleucin, leucin, valin, 2-oxo-3methyl-valerová kyselina, 2-oxo-isovalerová kyselina, 2-methyl-3-hydroxymáselná kyselina, 3-hydroxybutyrát, 3-hydroxybutyrát, Kyselina 3-hydroxyisovalerová, threonin, laktát, kyselina 3-hydroxymethylglutamová, alanin, N-acetylasparagin + aspartylglutamát + kyselina glutamilová, kyselina octová, karnitin, aceton, acetoacetát, 2-hydroxyglutarát, pyruvát, kyselina glutarová, kyselina N-Acetylglutamová sukcinát, kyselina 3-hydroxy-3-methylglukarová, dimethylamin, sarkosin, N-acetyl-aspartyl-glutamát, dimethylglycin, kyselina citrónová, kreatin, kreatinin, cholin, betain, kyselina malonová, trimethylaminoxid, sarkosin, glycin, 1-methylhistidin, 3 hodnoceny budou -methylhistidin, benzoilglycin (kyselina hippurová), N-methylbetain (trigonellina), arabinosio, uracil, guanosin, tyrosin, fenylalanin, xanthin, hypoxantin, 3-methylhistidin. Kromě toho se u dětí s CD očekává mnoho dalších signálů metabolitů, které vyplývají z léků nebo jiných sloučenin užívaných jako takové nebo zpracovávaných tělesným metabolismem nebo střevní mikrobiální flórou. metabolomická analýza umožní vyhodnocení následujících orgánově specifických a systémových procesů na bázi nízkomolekulárních sloučenin poskytujících profil metabolického systému subjektů: intermediární metabolismus cukru, mitochondriální cyklus kyseliny citrónové, metabolismus aminokyselin, oxidativní metabolismus tuků kyselina, rozklad a přeměna bílkovin, metabolismus purinu a pyrimidinu, cesta trans-methylace a trans-sulfidu, metabolismus střevních bakterií; atd.

PCDAI a globální hodnocení lékaře byly použity k měření aktivity onemocnění. Žádná aktivita onemocnění se rovná skóre 0-10, mírné onemocnění se rovná 11-30, středně těžké/závažné onemocnění se rovná 31 nebo více. (10)

Na začátku a ve 24. týdnu budou pacienti podrobeni ileokolonoskopii ke zhodnocení endoskopické a histologické aktivity onemocnění. Hodnocení mikrobioty na biopsiích a vzorcích stolice bude provedeno v době ileokolonoskopie pomocí FISH (Fluorescence In situ Hybridization). Kultivace tlustého střeva bude provedena za účelem vyhodnocení všech cytokinů a chemokinů multiplexním testem. Kromě toho bude provedena analýza RNA z biopsií pro studium proteazomových podjednotek nebo jiných zánětlivých markerů

Během studie budou shromážděna další data týkající se bezpečnosti a snášenlivosti terapie VSL #3.