Uno studio prospettico, controllato con placebo, in doppio cieco, incrociato sugli effetti di una preparazione probiotica (VSL#3) su profilo metabolico, permeabilità intestinale, microbiota, espressione di citochine e chemochine e altri marcatori infiammatori in pazienti pediatrici con malattia di Crohn

Le malattie infiammatorie intestinali (IBD) nell'infanzia sono condizioni infiammatorie croniche recidivanti e remittente che hanno un impatto significativo sulla crescita e sullo sviluppo.

L'IBD comporta il passaggio da una risposta immunitaria intestinale regolata a una che è guidata dall'attivazione sfrenata delle cellule immunitarie e dalla produzione di citochine pro-infiammatorie. (1) La causa di questo aumento della stimolazione immunitaria è di grande interesse e diversi studi indicano un ruolo dei batteri commensali nella progressione della malattia. (2) Uno studio recente ha confrontato il microbiota dei pazienti con IBD con quello dei controlli non IBD e ha rivelato una differenza significativa nella loro composizione. Il microbiota dei pazienti con IBD ha mostrato una composizione microbica anormale caratterizzata dalla deplezione di Firmicutes e Bacteroides, che sono rappresentati nei controlli non IBD. (3)

L'attività potenziata di NF-κB è coinvolta nella patologia di entrambe le forme di IBD. Malattia di Crohn (CD) e colite ulcerosa (CU). È stato studiato il meccanismo dell'attivazione di NF-κB mediata dal proteasoma in CD e UC. Visekruna et al hanno dimostrato che la composizione delle subunità e la funzione proteolitica dei proteasomi differiscono tra CU e CD. L'elevata espressione delle subunità dell'immunoproteasoma β1i e β2i è caratteristica della mucosa infiammata della MC (4). In linea con questo, hanno trovato una migliore elaborazione del precursore NF-κB p105 e la degradazione dell'inibitore di NF-κB, IκBα, da parte di immunoproteasomi isolati dalla mucosa dei pazienti con CD. Rispetto ai controlli sani e ai pazienti CD, i pazienti con CU hanno mostrato un fenotipo intermedio per quanto riguarda l'elaborazione/degradazione mediata dal proteasoma dei componenti NF-κB (4). Infine, una maggiore espressione del membro della famiglia NF-κB c-Rel nella mucosa infiammata dei pazienti CD suggerisce che p50/c-Rel è importante per l'induzione di immunoproteasomi mediata da IFN-γ tramite risposte Th1 guidate da IL-12. Questi risultati suggeriscono che distinte subunità del proteasoma influenzano l'intensità dell'infiammazione mediata da NF-κB nei pazienti con IBD (4).

Nello studio di Pagnini C et al., gli autori riportano che la miscela probiotica VSL#3 previene l'insorgenza dell'infiammazione intestinale nel modello murino SAMP di CD-ileite. Questi effetti erano associati a un effetto locale sull'epitelio intestinale (cioè stimolazione della produzione di TNF-α e attivazione di NF-κB nelle cellule epiteliali, insieme alla restituzione della normale funzione di barriera epiteliale intestinale).

L'analisi del DNA batterico nelle feci e nella mucosa ileale dei topi trattati ha dimostrato un aumento significativo dei ceppi probiotici, suggerendo che è necessaria un'efficace colonizzazione batterica per gli effetti benefici del trattamento probiotico. Questo studio supporta l'ipotesi che i probiotici promuovano la salute dell'intestino attraverso un meccanismo che coinvolge la stimolazione delle risposte epiteliali innate (cioè la stimolazione dell'espressione del TNF-α), piuttosto che la soppressione dell'infiammazione. (5)

È stato dimostrato che molte specie batteriche singole o combinazioni di specie migliorano i sintomi dell'IBD e riducono l'infiammazione intestinale negli studi sugli animali. Il trattamento di topi con colite con la formulazione probiotica VSL#3 ha aumentato la produzione di IL-10 e la percentuale di cellule T che esprimono TGFβ. Il trasferimento di cellule mononucleari della lamina propria da topi trattati con VSL#3 ha prevenuto la colite nei topi riceventi, indicando che il VSL#3 può avviare la generazione di una popolazione protettiva di cellule. (6)

La recente identificazione di batteri simbiotici con potenti proprietà antinfiammatorie e la loro correlativa assenza durante la malattia suggerisce che alcuni aspetti della salute umana possono dipendere dallo stato del microbiota. (7)

Inoltre, il lipopolisaccaride (LPS) è un componente importante della membrana esterna batterica che è ampiamente responsabile della mediazione dello shock settico. Normalmente il corpo non reagisce all'elevata concentrazione di LPS presente nel lume intestinale. La fosfatasi alcalina intestinale (IAP) sembra disintossicare LPS idrolizzandolo e mantenendo l'omeostasi intestinale con la flora commensale. (8)

I probiotici modulano la composizione del microbiota intestinale. L'analisi globale di microarray e bioinformatica ha rivelato un aumento della risposta immunitaria, delle vie fagocitiche e infiammatorie dominate dall'elevazione dei fattori di trascrizione Th1 nei topi IL10-KO. I topi IL10-KO somministrati per via orale con il probiotico VSL#3 hanno mostrato una downregulation sito-specifica di queste vie infiammatorie, inclusa la segnalazione TLR e le relative vie effettrici come la segnalazione dei recettori delle cellule T e delle cellule B. Ancora più importante, VSL#3 ha innescato una up-regulation nella segnalazione PPAR, nel metabolismo dei lipidi, dell'azoto, degli aminoacidi e degli xenobiotici (9).

In realtà non è chiaro come i cambiamenti indotti da VSL#3 nella composizione microbica influenzino lo stato dell'infiammazione intestinale. È possibile che VSL#3 promuova la presenza di microrganismi protettivi, probabili costituenti del probiotico stesso che influenzano direttamente le risposte innate dell'ospite. È stato riportato che VSL#3 modula la funzione di barriera, la permeabilità intestinale e le funzioni innate dell'ospite, che se alterate potrebbero avere un profondo impatto sullo stato della colite. È stato dimostrato che VSL#3 migliora la funzione di barriera attraverso una ridotta permeabilità epiteliale nei topi IL10_/_, correlandosi con una riduzione dell'infiammazione intestinale. Un altro studio recente ha dimostrato che VSL#3 previene lo sviluppo di ileite nei topi SAMP1/YitFc migliorando la funzione di barriera epiteliale e attivando la segnalazione innata che porta all'attivazione di NF-jB. Questi effetti sembrano essere mediati dai prodotti secreti dal VSL#3. Ciò è coerente con i rapporti che mostrano che i fattori derivati ​​dai probiotici sono in grado di modulare le risposte dell'ospite e la colite sperimentale. Inoltre, i componenti strutturali presenti nei batteri probiotici potrebbero avere un profondo impatto sulla risposta immunitaria e favorire la produzione di molecole immunosoppressive come IL-10 (10).

Scopo:

Lo scopo di questo studio è valutare l'effetto di una formulazione probiotica, VSL#3, rispetto al placebo, su profilo metabolico, permeabilità intestinale, microbiota, espressione di citochine e chemochine e altri marcatori infiammatori in pazienti pediatrici con malattia di Crohn (CD) in remissione (11).

Obiettivi secondari sono:

• Per determinare l'effetto sull'indice di attività della malattia di Crohn pediatrico (PCDAI)
• per determinare il tempo fino alla riacutizzazione dei pazienti pediatrici CD su VSL#3 rispetto al placebo
• per valutare se la terapia concomitante con VSL#3 riduce la gravità di una riacutizzazione se si verifica
• valutare la sicurezza e la tollerabilità della terapia con VSL #3 ad alto dosaggio nei pazienti pediatrici con CD

Progettazione dello studio

Questa indagine sarà uno studio incrociato randomizzato, in doppio cieco, controllato con placebo. Lo studio includerà 30 bambini con CD e sarà articolato in 6 mesi come segue. Un gruppo di 10 bambini volontari sani, comparabili per età e sesso, sarà utilizzato come gruppo di riferimento per l'analisi del profilo metabolico.

Questi bambini saranno randomizzati in un gruppo di trattamento che riceverà per 2 mesi 1-2 pacchetti contenenti 900 miliardi di batteri/giorno di VSL#3 in base al loro peso e in un gruppo che riceverà il farmaco placebo. L'assegnazione alla terapia o al placebo sarà determinata secondo uno schema di randomizzazione generato dal computer. I farmaci saranno dispensati dallo sperimentatore ad ogni visita; la conformità sarà valutata contando i bagagli restituiti e interrogando i pazienti. La conformità eccellente sarà definita come nessuna violazione del protocollo per quanto riguarda l'assunzione del farmaco in studio. Al termine delle 8 settimane, verrà effettuato un periodo di "wash-out" di 6 settimane, durante il quale non verrà somministrata alcuna preparazione. Quindi ogni paziente verrà trasferito all'altro gruppo e seguito allo stesso modo per ulteriori 8 settimane.

Tutti i pazienti continueranno i farmaci regolari per tutto il periodo di studio (azatioprina associata o meno a 5-ASA).

I pazienti saranno valutati clinicamente al basale e ogni 8 settimane fino al completamento dello studio, a 24 settimane o al momento della ricaduta. Ad ogni visita verranno raccolti i dati, compresi i questionari dei pazienti relativi all'attività della malattia (frequenza delle feci, consistenza delle feci, ematochezia, dolore addominale, manifestazioni extraintestinali della malattia e funzionamento generale del paziente). Ulteriori informazioni raccolte alla prima visita includevano dati demografici, storia familiare e insorgenza dei sintomi. L'esame fisico verrà eseguito ad ogni visita da un pediatra e includerà un esame addominale e un esame per manifestazioni extraintestinali di MC. Ad ogni visita e/o al momento della recidiva verranno eseguiti esami del sangue di routine per MC, studio della permeabilità intestinale tenue cellobiosio/mannitolo, colture fecali, calprotectina fecale. Le urine saranno raccolte per l'analisi del profilo metabolico con spettroscopia 1H NMR mono e bidimensionale ad alta risoluzione. In 10 bambini e pazienti volontari sani, acido biliare, isoleucina, leucina, valina, acido 2-osso-3metil-valerico, acido 2-osso-isovalerico, acido 2-metil-3-idrossibutirrico, 3-idrossibutirrato, 3-idrossibutirrato, acido 3-idrossiisovalerico, treonina, lattato, acido 3-idrossimetilglutammico, alanina, N-acetil asparagina + aspartil glutammato + acido glutamil, acido acetico, carnitina, acetone, acetoacetato, 2-idrossiglutarato, piruvato, acido glutarico, acido N-acetilglutammico, succinato, acido 3-idrossi-3-metilglucarico, dimetilammina, sarcosina, N-acetil-aspartil-glutammato, dimetilglicina, acido citrico, creatina, creatinina, colina, betaina, acido malonico, trimetilamminoossido, sarcosina, glicina, 1-metilistidina, 3 -metilistidina, benzoilglicina (acido ippurico), N-metilbetaina (trigonellina), arabinosio, uracile, guanosina, tirosina, fenilalanina, xantina, ipoxantina, 3-metilistidina. Inoltre, nei bambini con CD, ci si aspetteranno molti altri segnali di metaboliti, derivanti da farmaci o altri composti assunti come tali o elaborati dal metabolismo del corpo o dalla flora microbica intestinale. l'analisi metabolomica consentirà la valutazione dei seguenti processi organo specifici e sistemici basati su composti a basso peso molecolare fornendo un profilo del sistema metabolico dei soggetti: metabolismo intermedio degli zuccheri, ciclo mitocondriale dell'acido citrico, metabolismo degli aminoacidi, metabolismo ossidativo dei grassi acido, scomposizione e turnover delle proteine, metabolismo delle purine e delle pirimidine, via della trans-metilazione e del trans-solfuro, metabolismo dei batteri intestinali; eccetera.

PCDAI e valutazione globale di un medico sono stati utilizzati per misurare l'attività della malattia. Nessuna attività di malattia equivale a un punteggio compreso tra 0 e 10, malattia lieve equivale a 11-30, malattia moderata/grave equivale a 31 o più. (10)

Al basale ea 24 settimane i pazienti saranno sottoposti a ileocolonscopia per valutare l'attività endoscopica e istologica della malattia. La valutazione del microbiota su biopsie e campioni di feci verrà eseguita al momento delle ileocolonoscopie mediante FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). Verrà eseguita una coltura del colon per valutare tutte le citochine e le chemochine mediante test multiplex. Inoltre, verrà eseguita l'analisi dell'RNA da biopsie per lo studio delle subunità del proteasoma o di altri marcatori infiammatori

Ulteriori dati saranno raccolti durante lo studio per quanto riguarda la sicurezza e la tollerabilità della terapia con VSL #3.