En prospektiv, placebo-kontrolleret, dobbeltblind, cross-over-undersøgelse af virkningerne af et probiotisk præparat (VSL#3) på metabolisk profil, tarmpermeabilitet, mikrobiota, cytokiner og kemokiner ekspression og andre inflammatoriske markører hos pædiatriske patienter med Crohns sygdom

Inflammatorisk tarmsygdom (IBD) i barndommen er kroniske recidiverende og remitterende inflammatoriske tilstande, som har en væsentlig indflydelse på vækst og udvikling.

IBD involverer et skift fra en reguleret intestinal immunrespons til en, der er drevet af uhæmmet immuncelleaktivering og pro-inflammatorisk cytokinproduktion. (1) Årsagen til denne stigning i immunstimulering er af stor interesse, og adskillige undersøgelser indikerer en rolle for kommensale bakterier i udviklingen af ​​sygdommen. (2) En nylig undersøgelse sammenlignede mikrobiotaen hos patienter med IBD med den for ikke-IBD-kontroller og afslørede en signifikant forskel i deres sammensætning. Mikrobiotaen af ​​IBD-patienter viste unormal mikrobiel sammensætning karakteriseret ved udtømning af Firmicutes og Bacteroides, som er repræsenteret i ikke-IBD kontroller. (3)

Forøget NF-KB-aktivitet er involveret i patologien af ​​begge former for IBD. Crohns sygdom (CD) og colitis ulcerosa (UC). Mekanismen for proteasom-medieret NF-KB-aktivering i CD og UC er blevet undersøgt. Visekruna et al påviste, at underenhedssammensætningen og den proteolytiske funktion af proteasomer adskiller sig mellem UC og CD. Høj ekspression af immunproteasomunderenhederne β1i og β2i er karakteristisk for den betændte slimhinde på CD (4). I tråd med dette fandt de forbedret behandling af NF-KB-precursor p105 og nedbrydning af inhibitor af NF-KB, IκBα, af immunproteasomer isoleret fra slimhinden hos CD-patienter. I sammenligning med raske kontroller og CD-patienter udviste UC-patienter en mellemliggende fænotype vedrørende den proteasom-medierede bearbejdning/nedbrydning af NF-KB-komponenter (4). Endelig øget ekspression af NF-KB-familiemedlemmet c-Rel i den betændte slimhinde af CD-patienter tyder på, at p50/c-Rel er vigtig for IFN-y-medieret induktion af immunproteasomer via IL-12-drevne Th1-responser. Disse resultater tyder på, at distinkte proteasomunderenheder påvirker intensiteten af ​​NF-KB-medieret inflammation hos IBD-patienter (4).

I undersøgelsen af ​​Pagnini C et al. rapporterer forfatterne, at den probiotiske blanding VSL#3 forhindrer indtræden af ​​tarmbetændelse i SAMP-musemodellen af ​​CD-ileitis. Disse virkninger var forbundet med en lokal effekt på tarmepitelet (dvs. stimulering af TNF-a-produktion og NF-KB-aktivering i epitelceller, kombineret med restitution af normal tarmepitelbarrierefunktion).

Analyse af bakterielt DNA i afføring og ileal slimhinde hos behandlede mus viste en signifikant stigning i probiotiske stammer, hvilket tyder på, at effektiv bakteriel kolonisering er nødvendig for de gavnlige virkninger af probiotisk behandling. Denne undersøgelse understøtter hypotesen om, at probiotika fremmer tarmsundheden gennem en mekanisme, der involverer stimulering af epiteliale medfødte responser (dvs. stimulering af TNF-α-ekspression), snarere end undertrykkelse af inflammation. (5)

Mange individuelle eller kombinationer af bakteriearter har vist sig at lindre symptomerne på IBD og reducere tarmbetændelse i dyreforsøg. Behandling af mus med colitis med den probiotiske formulering VSL#3 øgede produktionen af ​​IL-10 og procentdelen af ​​TGFβ-udtrykkende T-celler. Overførsel af mononukleære lamina propria-celler fra VSL#3-behandlede mus forhindrede colitis i modtagermus, hvilket indikerer, at VSL#3 kan initiere dannelsen af ​​en beskyttende population af celler. (6)

Den nylige identifikation af symbiotiske bakterier med kraftige antiinflammatoriske egenskaber og deres korrelative fravær under sygdom, tyder på, at visse aspekter af menneskers sundhed kan afhænge af mikrobiotas status. (7)

Derudover er Lipopolysaccharidet (LPS) en vigtig bestanddel af den bakterielle ydre membran, der i høj grad er ansvarlig for at mediere septisk shock. Normalt reagerer kroppen ikke på den høje koncentration af LPS, der er til stede i tarmens lumen. Intestinal alkalisk phosphatase (IAP) ser ud til at afgifte LPS ved at hydrolysere det og opretholde tarmhomeostase med den kommensale flora. (8)

Probiotika modulerer sammensætningen af ​​tarmmikrobiotaen. Global mikroarray og bioinformatica-analyse afslørede forøgelse af immunrespons, fagocytiske og inflammatoriske veje domineret af forhøjelse af Th1-transkriptionsfaktorer i IL10-KO-mus. IL10-KO-mus administreret oralt med det probiotiske VSL#3 udviste en stedspecifik nedregulering af disse inflammatoriske veje, herunder TLR-signalering og relaterede effektorveje, såsom T-celle, B-celle-receptorsignalering. Endnu vigtigere, VSL#3 udløste en opregulering i PPAR-signalering, lipid, nitrogen, aminosyre og xenobiotisk metabolisme (9).

Faktisk er det uklart, hvordan VSL#3-inducerede ændringer i mikrobiel sammensætning påvirker status for tarmbetændelse. Det er muligt, at VSL#3 fremmer tilstedeværelsen af ​​beskyttende mikroorganismer, sandsynlige bestanddele af selve probiotikaet, som direkte påvirker værtens medfødte responser. Det er blevet rapporteret, at VSL#3 modulerer barrierefunktion, intestinal permeabilitet og medfødte værtsfunktioner, som, hvis de ændres, kan have en dyb indvirkning på colitistilstanden. VSL#3 har vist sig at forbedre barrierefunktionen gennem nedsat epitelpermeabilitet hos IL10_/_ mus, hvilket korrelerer med en reduktion i tarmbetændelse. En anden nylig undersøgelse viste, at VSL#3 forhindrer udviklingen af ​​ileitis i SAMP1/YitFc-mus ved at forbedre epitelbarrierefunktionen og aktivere medfødt signalering, der fører til NF-jB-aktivering. Disse effekter synes at være medieret af VSL#3-udskilte produkter. Dette er i overensstemmelse med rapporter, der viser, at probiotika-afledte faktorer er i stand til at modulere værtsresponser og eksperimentel colitis. Derudover kan strukturelle komponenter, der er til stede i probiotiske bakterier, i høj grad påvirke immunrespons og favorisere produktionen af ​​immunsuppressive molekyler såsom IL-10 (10).

Formål:

Formålet med denne undersøgelse er at evaluere effekten af ​​en probiotisk formulering, VSL#3, versus placebo på metabolisk profil, intestinal permeabilitet, mikrobiota, cytokiner og kemokinekspression og andre inflammatoriske markører hos pædiatriske patienter med Crohns sygdom (CD) i remission (11).

Sekundære mål er:

• For at bestemme effekten på Pediatric Crohn Disease Activity Index (PCDAI)
• at bestemme tiden indtil opblussen af ​​CD pædiatriske patienter på VSL#3 sammenlignet med placebo
• at vurdere, om samtidig behandling med VSL#3 reducerer sværhedsgraden af ​​en opblussen, hvis den opstår
• at vurdere sikkerheden og tolerabiliteten af ​​behandling med VSL #3 ved høje doser hos pædiatriske patienter med CD

Studere design

Denne undersøgelse vil være et randomiseret, dobbeltblindt, placebokontrolleret, cross-over forsøg. Undersøgelsen vil omfatte 30 børn med CD og vil blive artikuleret på 6 måneder som følger. En gruppe på 10 frivillige raske børn, sammenlignelige i alder og køn, vil blive brugt som referencegruppe til analyse af metabolisk profil.

Disse børn vil blive randomiseret til en behandlingsgruppe, der i 2 måneder modtager enten 1-2 pakker indeholdende 900 milliarder bakterier/dag af VSL#3 i henhold til deres vægt, og en gruppe, der modtager placebo-lægemidlet. Tildeling til terapi eller placebo vil blive bestemt i henhold til et computergenereret randomiseringsskema. Medicinen vil blive udleveret af investigator ved hvert besøg; compliance vil blive vurderet ved at tælle returnerede poser og udspørge patienterne. Fremragende compliance vil blive defineret som ingen overtrædelse af protokollen med hensyn til indtagelse af undersøgelsesmedicinen. Ved afslutningen af ​​de 8 uger vil der blive foretaget en "wash-out" periode på 6 uger, hvor der ikke vil blive indgivet præparat. Derefter skiftes hver patient til den anden gruppe og følges ligeledes i yderligere 8 uger.

Alle patienter vil fortsætte med regelmæssig medicin gennem hele undersøgelsesperioden (azathioprin associeret eller ej til 5-ASA).

Patienterne vil blive vurderet klinisk ved baseline og hver 8. uge indtil afslutningen af ​​undersøgelsen, ved 24 uger eller på tidspunktet for tilbagefald. Ved hvert besøg vil der blive indsamlet data, herunder patientspørgeskemaer vedrørende sygdomsaktivitet (afføringshyppighed, afføringskonsistens, hæmatochezi, mavesmerter, ekstraintestinale manifestationer af sygdom og overordnet patientfunktion). Yderligere oplysninger indsamlet ved det første besøg omfattede demografiske data, familiehistorie og symptomdebut. Fysisk undersøgelse vil blive udført ved hvert besøg af en børnelæge og inkluderet en abdominal undersøgelse og undersøgelse for ekstraintestinale manifestationer af CD. Rutinemæssige blodprøver for CD, cellobiose/mannitol tyndtarmspermeabilitetsundersøgelse, afføringskulturer, afføringscalprotectin, vil blive udført ved hvert besøg og/eller på tidspunktet for tilbagefald. Urin vil blive indsamlet til analyse af metabolisk profil med mono- og bidimensionel højopløsnings 1H NMR-spektroskopi. Hos 10 raske frivillige børn og patienter, galdesyre, isoleucin, leucin, valin, 2-oxo-3methyl-valerianesyre, 2-oxo-isovalerianesyre, 2-methyl-3-hydroxysmørsyre, 3-hydroxybutyrat, 3-hydroxybutyrat, 3-hydroxyisovalerianesyre, threonin, lactat, 3-hydroximethylglutaminsyre, alanin, N-acetylasparagin + aspartylglutamat + glutamilsyre, eddikesyre, carnitin, acetone, acetoacetat, 2-hydroxyglutarat, pyruvat, N-Acetylglutarsyre, glutaminsyre, succinat, 3-hydroxy-3-methylglucarsyre, dimethylamin, sarcosin, N-acetyl-aspartylglutamat, dimethylglycin, citronsyre, kreatin, kreatinin, cholin, betain, malonsyre, trimethylaminoxid, sarcosin, glycidin, 1-3-methyl -methylhistidin, benzoilglycin (hippursyre), N-methylbetain (trigonellina), arabinosio, uracil, guanosin, tyrosin, phenylalanin, xanthin, hypoxanthin, 3-methylhistidin vil blive evalueret. Derudover vil der hos børn med CD forventes mange andre metabolitter-signaler, som er et resultat af lægemidler eller andre forbindelser, der tages som sådan eller behandles af kroppens metabolisme eller tarmmikrobielle flora. den metabolomiske analyse vil muliggøre evaluering af følgende organspecifikke og systemiske processer baseret på lavmolekylære forbindelser, der giver en profil af forsøgspersonernes metaboliske system: mellemliggende metabolisme af sukker, mitokondriel citronsyrecyklus, aminosyremetabolisme, oxidativ metabolisme af fedtstoffer syre, nedbrydning og omsætning af proteiner, metabolisme af purin og pyrimidin, trans-methyleringsvej og trans-sulfid, metabolisme af tarmbakterier; etc.

PCDAI og en læges globale vurdering blev brugt til at måle sygdomsaktivitet. Ingen sygdomsaktivitet er lig med en score på 0-10, mild sygdom er lig med 11-30, moderat/alvorlig sygdom er lig med 31 eller mere. (10)

Ved baseline og ved 24 uger vil patienterne gennemgå ileokolonoskopi for at evaluere sygdommens endoskopiske og histologiske aktivitet. Evaluering af mikrobiota på biopsier og afføringsprøver vil blive udført på tidspunktet for ileokolonoskopier ved hjælp af FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). En kolonkultur vil blive udført for at evaluere alle cytokiner og kemokiner ved multipleks assay. Derudover vil RNA-analysen fra biopsier blive udført til undersøgelse af proteasomunderenheder eller andre inflammatoriske markører

Yderligere data vil blive indsamlet under undersøgelsen vedrørende sikkerhed og tolerabilitet af behandling med VSL #3.