Estudio prospectivo, cruzado, doble ciego, controlado con placebo sobre los efectos de una preparación probiótica (VSL#3) en el perfil metabólico, la permeabilidad intestinal, la microbiota, la expresión de citocinas y quimiocinas y otros marcadores inflamatorios en pacientes pediátricos con enfermedad de Crohn

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) en la infancia es una afección inflamatoria crónica remitente y recurrente que tiene un impacto significativo en el crecimiento y el desarrollo.

La EII implica un cambio de una respuesta inmunitaria intestinal regulada a una impulsada por la activación desenfrenada de las células inmunitarias y la producción de citoquinas proinflamatorias. (1) La causa de este aumento en la estimulación inmunológica es de gran interés y varios estudios indican un papel de las bacterias comensales en la progresión de la enfermedad. (2) Un estudio reciente comparó la microbiota de pacientes con EII con la de controles sin EII y reveló una diferencia significativa en su composición. La microbiota de los pacientes con EII mostró una composición microbiana anormal caracterizada por el agotamiento de Firmicutes y Bacteroides, que están representados en los controles sin EII. (3)

La actividad mejorada de NF-κB está involucrada en la patología de ambas formas de EII. Enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa (CU). Se ha estudiado el mecanismo de activación de NF-κB mediada por proteasoma en EC y CU. Visekruna et al demostraron que la composición de subunidades y la función proteolítica de los proteasomas difieren entre UC y CD. La alta expresión de las subunidades β1i y β2i del inmunoproteasoma es característica de la mucosa inflamada de la EC (4). De acuerdo con esto, encontraron un procesamiento mejorado del precursor p105 de NF-κB y la degradación del inhibidor de NF-κB, IκBα, por inmunoproteasomas aislados de la mucosa de pacientes con EC. En comparación con los controles sanos y los pacientes con EC, los pacientes con CU exhibieron un fenotipo intermedio con respecto al procesamiento/degradación mediado por proteasoma de los componentes de NF-κB (4). Finalmente, aumentó la expresión del miembro de la familia NF-κB c-Rel en la mucosa inflamada. de pacientes con EC sugiere que p50/c-Rel es importante para la inducción de inmunoproteasomas mediada por IFN-γ a través de respuestas Th1 impulsadas por IL-12. Estos hallazgos sugieren que distintas subunidades de proteasoma influyen en la intensidad de la inflamación mediada por NF-κB en pacientes con EII (4).

En el estudio de Pagnini C et al., los autores informan que la mezcla probiótica VSL#3 previene la aparición de inflamación intestinal en el modelo de ratón SAMP de CD-ileítis. Estos efectos se asociaron con un efecto local sobre el epitelio intestinal (es decir, la estimulación de la producción de TNF-α y la activación de NF-κB en las células epiteliales, junto con la restitución de la función de barrera epitelial intestinal normal).

El análisis del ADN bacteriano en las heces y la mucosa ileal de los ratones tratados demostró un aumento significativo de las cepas de probióticos, lo que sugiere que se requiere una colonización bacteriana efectiva para los efectos beneficiosos del tratamiento con probióticos. Este estudio respalda la hipótesis de que los probióticos promueven la salud intestinal a través de un mecanismo que involucra la estimulación de respuestas epiteliales innatas (es decir, la estimulación de la expresión de TNF-α), en lugar de la supresión de la inflamación. (5)

Se ha demostrado que muchas especies bacterianas individuales o combinadas mejoran los síntomas de la EII y reducen la inflamación intestinal en estudios con animales. El tratamiento de ratones con colitis con la formulación probiótica VSL#3 aumentó la producción de IL-10 y el porcentaje de células T que expresan TGFβ. La transferencia de células mononucleares de lámina propia de ratones tratados con VSL#3 evitó la colitis en los ratones receptores, lo que indica que VSL#3 puede iniciar la generación de una población protectora de células. (6)

La reciente identificación de bacterias simbióticas con potentes propiedades antiinflamatorias y su correlativa ausencia durante la enfermedad sugiere que ciertos aspectos de la salud humana pueden depender del estado de la microbiota. (7)

Además, el lipopolisacárido (LPS) es un componente principal de la membrana externa bacteriana que es en gran parte responsable de mediar en el shock séptico. Normalmente, el cuerpo no reacciona a la alta concentración de LPS que está presente en la luz intestinal. La fosfatasa alcalina intestinal (IAP) parece desintoxicar el LPS hidrolizándolo y manteniendo la homeostasis intestinal con la flora comensal. (8)

Los probióticos modulan la composición de la microbiota intestinal. El análisis global de micromatrices y bioinformática reveló un aumento de la respuesta inmunitaria, las vías fagocíticas e inflamatorias dominadas por la elevación de los factores de transcripción Th1 en ratones IL10-KO. Los ratones IL10-KO administrados por vía oral con el probiótico VSL#3 exhibieron una regulación a la baja específica del sitio de estas vías inflamatorias, incluida la señalización de TLR y vías efectoras relacionadas, como la señalización del receptor de células T y células B. Más importante aún, VSL#3 desencadenó una regulación positiva en la señalización de PPAR, el metabolismo de lípidos, nitrógeno, aminoácidos y xenobióticos (9).

En realidad, no está claro cómo los cambios en la composición microbiana inducidos por VSL#3 afectan el estado de la inflamación intestinal. Es posible que VSL#3 promueva la presencia de microorganismos protectores, probablemente constituyentes del propio probiótico que influyen directamente en las respuestas innatas del huésped. Se ha informado que VSL#3 modula la función de barrera, la permeabilidad intestinal y las funciones innatas del huésped, que si se alteran, podrían tener un profundo impacto en el estado de la colitis. Se ha demostrado que VSL#3 mejora la función de barrera a través de la disminución de la permeabilidad epitelial en ratones IL10_/_, lo que se correlaciona con una reducción de la inflamación intestinal. Otro estudio reciente demostró que VSL#3 previene el desarrollo de ileítis en ratones SAMP1/YitFc al mejorar la función de barrera epitelial y activar la señalización innata que lleva a la activación de NF-jB. Estos efectos parecen estar mediados por productos secretados por VSL#3. Esto es consistente con los informes que muestran que los factores derivados de probióticos son capaces de modular las respuestas del huésped y la colitis experimental. Además, los componentes estructurales presentes en las bacterias probióticas podrían impactar profundamente en la respuesta inmune y favorecer la producción de moléculas inmunosupresoras como la IL-10 (10).

Objetivo:

El propósito de este estudio es evaluar el efecto de una formulación probiótica, VSL#3, versus placebo, sobre el perfil metabólico, la permeabilidad intestinal, la microbiota, la expresión de citocinas y quimiocinas y otros marcadores inflamatorios en pacientes pediátricos con enfermedad de Crohn (EC) en remisión. (11).

Los objetivos secundarios son:

• Determinar el efecto sobre el índice de actividad de la enfermedad de Crohn pediátrica (PCDAI)
• para determinar el tiempo hasta el brote de pacientes pediátricos con EC en VSL#3 en comparación con placebo
• para evaluar si la terapia concurrente con VSL#3 reduce la gravedad de un brote si ocurre
• evaluar la seguridad y tolerabilidad de la terapia con VSL #3 en dosis altas en pacientes pediátricos con EC

Diseño del estudio

Esta investigación será un ensayo cruzado, aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo. El estudio incluirá a 30 niños con EC y se articulará en 6 meses de la siguiente manera. Un grupo de 10 niños sanos voluntarios, comparables en edad y sexo, se utilizará como grupo de referencia para el análisis del perfil metabólico.

Estos niños serán asignados al azar a un grupo de tratamiento que recibirá durante 2 meses 1 o 2 paquetes que contienen 900 mil millones de bacterias/día de VSL#3 según su peso, y un grupo que recibirá el fármaco placebo. La asignación a terapia o placebo se determinará de acuerdo con un esquema de aleatorización generado por computadora. Los medicamentos serán dispensados ​​por el investigador en cada visita; el cumplimiento se evaluará contando las bolsas devueltas e interrogando a los pacientes. El cumplimiento excelente se definirá como la ausencia de violación del protocolo con respecto a la toma de la medicación del estudio. Al completar las 8 semanas, se realizará un período de "lavado" de 6 semanas, en el que no se administrará ningún preparado. Luego, cada paciente se cambiará al otro grupo y se seguirá de la misma manera durante otras 8 semanas.

Todos los pacientes continuarán con la medicación habitual durante todo el periodo de estudio (azatioprina asociada o no a 5-ASA).

Los pacientes serán evaluados clínicamente al inicio del estudio y cada 8 semanas hasta la finalización del estudio, a las 24 semanas o en el momento de la recaída. En cada visita se recopilarán datos, incluidos cuestionarios del paciente sobre la actividad de la enfermedad (frecuencia de las heces, consistencia de las heces, hematoquecia, dolor abdominal, manifestaciones extraintestinales de la enfermedad y funcionamiento general del paciente). La información adicional recopilada en la primera visita incluyó datos demográficos, antecedentes familiares y aparición de síntomas. El examen físico será realizado en cada visita por un pediatra e incluirá un examen abdominal y un examen de las manifestaciones extraintestinales de la EC. Se realizarán análisis de sangre de rutina para EC, estudio de permeabilidad del intestino delgado con celobiosa/manitol, coprocultivos, calprotectina en heces, en cada visita y/o en el momento de la recaída. La orina se recogerá para el análisis del perfil metabólico con espectroscopía de RMN 1H mono y bidimensional de alta resolución. En 10 niños y pacientes voluntarios sanos, ácido biliar, isoleucina, leucina, valina, ácido 2-oxo-3metil-valérico, ácido 2-oxo-isovalérico, ácido 2-metil-3-hidroxibutírico, 3-hidroxibutirato, 3-hidroxibutirato, Ácido 3-hidroxiisovalérico, treonina, lactato, ácido 3-hidroximetilglutámico, alanina, N-acetil asparagina + aspartil glutamato + ácido glutámico, ácido acético, carnitina, acetona, acetoacetato, 2-hidroxiglutarato, piruvato, ácido glutárico, ácido N-acetilglutámico, succinato, ácido 3-hidroxi-3-metilglucárico, dimetilamina, sarcosina, N-acetil-aspartil-glutamato, dimetilglicina, ácido cítrico, creatina, creatinina, colina, betaína, ácido malónico, trimetilaminoóxido, sarcosina, glicina, 1-metilhistidina, 3 -metilhistidina, benzoilglicina (ácido hipúrico), N-metil betaína (trigonellina), arabinosio, uracilo, guanosina, tirosina, fenilalanina, xantina, hipoxantina, 3-metilhistidina. Además, en niños con EC, se esperarán muchas otras señales de metabolitos, resultantes de fármacos u otros compuestos tomados como tales o procesados ​​por el metabolismo del cuerpo o la flora microbiana intestinal. el análisis metabolómico permitirá la evaluación de los siguientes procesos específicos de órganos y sistémicos basados ​​en compuestos de bajo peso molecular proporcionando un perfil del sistema metabólico de los sujetos: metabolismo intermediario del azúcar, ciclo del ácido cítrico mitocondrial, metabolismo de aminoácidos, metabolismo oxidativo de grasas ácido, descomposición y renovación de proteínas, metabolismo de purina y pirimidina, vía de transmetilación y transsulfuro, metabolismo de bacterias intestinales; etc.

Se utilizaron PCDAI y la evaluación global de un médico para medir la actividad de la enfermedad. La ausencia de actividad de la enfermedad equivale a una puntuación de 0 a 10, la enfermedad leve equivale a 11-30, la enfermedad moderada/grave equivale a 31 o más. (10)

Al inicio y a las 24 semanas, los pacientes se someterán a una ileocolonoscopia para evaluar la actividad endoscópica e histológica de la enfermedad. La evaluación de la microbiota en biopsias y muestras de heces se realizará en el momento de las ileocolonoscopias utilizando FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). Se realizará un cultivo de colon para evaluar todas las citocinas y quimiocinas mediante ensayo multiplex. Además, se realizará el análisis de ARN de biopsias para el estudio de subunidades de proteasoma u otros marcadores inflamatorios

Se recopilarán datos adicionales durante el estudio con respecto a la seguridad y tolerabilidad de la terapia con VSL #3.