Een prospectieve, placebogecontroleerde, dubbelblinde, cross-over studie naar de effecten van een probiotisch preparaat (VSL#3) op het metabolische profiel, de darmpermeabiliteit, de microbiota, de expressie van cytokines en chemokines en andere ontstekingsmarkers bij pediatrische patiënten met de ziekte van Crohn

Inflammatoire darmaandoeningen (IBD) in de kindertijd zijn chronische relapsing en remitting inflammatoire aandoeningen die een significante invloed hebben op de groei en ontwikkeling.

IBD omvat een verschuiving van een gereguleerde intestinale immuunrespons naar een respons die wordt aangestuurd door ongebreidelde activering van immuuncellen en pro-inflammatoire cytokineproductie. (1) De oorzaak van deze toename in immuunstimulatie is van groot belang en verschillende onderzoeken wijzen op een rol voor commensale bacteriën bij de progressie van de ziekte. (2) Een recente studie vergeleek de microbiota van patiënten met IBD met die van niet-IBD-controles en onthulde een significant verschil in hun samenstelling. De microbiota van IBD-patiënten vertoonde een abnormale microbiële samenstelling die wordt gekenmerkt door uitputting van Firmicutes en Bacteroides, die worden weergegeven in niet-IBD-controles. (3)

Verhoogde NF-KB-activiteit is betrokken bij de pathologie van beide vormen van IBD. Ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC). Het mechanisme van proteasoom-gemedieerde NF-KB-activering bij CD en UC is bestudeerd. Visekruna et al. toonden aan dat de samenstelling van de subeenheid en de proteolytische functie van proteasomen verschillen tussen UC en CD. Hoge expressie van de immunoproteasoom-subeenheden β1i en β2i is kenmerkend voor het ontstoken slijmvlies van CD (4). In overeenstemming hiermee vonden ze verbeterde verwerking van NF-KB-precursor p105 en afbraak van remmer van NF-KB, IκBα, door immunoproteasomen geïsoleerd uit het slijmvlies van CD-patiënten. In vergelijking met gezonde controles en CD-patiënten vertoonden UC-patiënten een intermediair fenotype met betrekking tot de proteasoom-gemedieerde verwerking/afbraak van NF-KB-componenten (4). Ten slotte verhoogde expressie van het NF-KB-familielid c-Rel in het ontstoken slijmvlies van CD-patiënten suggereert dat p50/c-Rel belangrijk is voor IFN-γ-gemedieerde inductie van immunoproteasomen via IL-12-aangedreven Th1-responsen. Deze bevindingen suggereren dat verschillende proteasoomsubeenheden de intensiteit van NF-KB-gemedieerde ontsteking bij IBD-patiënten beïnvloeden (4).

In de studie van Pagnini C et al. rapporteren de auteurs dat het probiotische mengsel VSL#3 het ontstaan ​​van darmontsteking voorkomt in het SAMP-muismodel van CD-ileïtis. Deze effecten waren geassocieerd met een lokaal effect op het darmepitheel (d.w.z. stimulatie van TNF-a-productie en NF-KB-activering in epitheelcellen, gekoppeld aan herstel van de normale darmepitheelbarrièrefunctie).

Analyse van bacterieel DNA in de ontlasting en het ileale slijmvlies van behandelde muizen toonde een significante toename van probiotische stammen aan, wat suggereert dat effectieve bacteriële kolonisatie vereist is voor de gunstige effecten van probiotische behandeling. Deze studie ondersteunt de hypothese dat probiotica de darmgezondheid bevorderen via een mechanisme waarbij epitheliale aangeboren reacties worden gestimuleerd (d.w.z. stimulatie van TNF-α-expressie), in plaats van onderdrukking van ontsteking. (5)

In dierstudies is aangetoond dat veel individuele of combinaties van bacteriesoorten de symptomen van IBD verlichten en darmontsteking verminderen. Behandeling van muizen met colitis met de probiotische formulering VSL#3 verhoogde de productie van IL-10 en het percentage TGFβ tot expressie brengende T-cellen. Overdracht van mononucleaire cellen van de lamina propria van met VSL#3 behandelde muizen voorkwam colitis bij ontvangende muizen, wat aangeeft dat de VSL#3 het genereren van een beschermende celpopulatie kan initiëren. (6)

De recente identificatie van symbiotische bacteriën met krachtige ontstekingsremmende eigenschappen en hun correlatieve afwezigheid tijdens ziekte, suggereert dat bepaalde aspecten van de menselijke gezondheid kunnen afhangen van de status van de microbiota. (7)

Bovendien is het lipopolysaccharide (LPS) een belangrijk onderdeel van het bacteriële buitenmembraan dat grotendeels verantwoordelijk is voor het mediëren van septische shock. Normaal reageert het lichaam niet op de hoge concentratie LPS die aanwezig is in het darmlumen. Intestinale alkalische fosfatase (IAP) lijkt LPS te ontgiften door het te hydrolyseren en de intestinale homeostase met de commensale flora te handhaven. (8)

Probiotica moduleren de samenstelling van de darmmicrobiota. Globale microarray- en bioinformatica-analyse onthulden een toename van de immuunrespons, fagocytische en ontstekingsroutes gedomineerd door verhoging van Th1-transcriptiefactoren in IL10-KO-muizen. IL10-KO-muizen die oraal werden toegediend met het probiotische VSL#3 vertoonden een plaatsspecifieke downregulatie van deze ontstekingsroutes, waaronder TLR-signalering en gerelateerde effectorroutes zoals T-cel, B-celreceptorsignalering. Wat nog belangrijker is, VSL # 3 veroorzaakte een opwaartse regulatie van PPAR-signalering, lipide-, stikstof-, aminozuur- en xenobiotisch metabolisme (9).

Het is eigenlijk onduidelijk hoe VSL#3-geïnduceerde veranderingen in microbiële samenstelling de status van darmontsteking beïnvloeden. Het is mogelijk dat VSL#3 de aanwezigheid van beschermende micro-organismen bevordert, waarschijnlijke bestanddelen van het probioticum zelf die de aangeboren reacties van de gastheer rechtstreeks beïnvloeden. Er is gemeld dat VSL # 3 de barrièrefunctie, darmpermeabiliteit en aangeboren gastheerfuncties moduleert, die, indien gewijzigd, een grote invloed kunnen hebben op de toestand van colitis. Van VSL#3 is aangetoond dat het de barrièrefunctie verbetert door verminderde epitheliale permeabiliteit in IL10_/_ muizen, wat correleert met een vermindering van darmontsteking. Een andere recente studie toonde aan dat VSL#3 de ontwikkeling van ileitis in SAMP1/YitFc-muizen voorkomt door de epitheliale barrièrefunctie te verbeteren en aangeboren signalering te activeren die leidt tot NF-jB-activering. Deze effecten lijken te worden gemedieerd door door VSL#3 uitgescheiden producten. Dit komt overeen met rapporten die aantonen dat van probiotica afgeleide factoren in staat zijn om reacties van de gastheer en experimentele colitis te moduleren. Bovendien kunnen structurele componenten die aanwezig zijn in probiotische bacteriën de immuunrespons diepgaand beïnvloeden en de productie van immunosuppressieve moleculen zoals IL-10 bevorderen (10).

Doel:

Het doel van deze studie is om het effect te evalueren van een probiotische formulering, VSL # 3, versus placebo, op het metabolische profiel, de darmpermeabiliteit, de microbiota, de expressie van cytokines en chemokines en andere ontstekingsmarkers bij pediatrische patiënten met de ziekte van Crohn (CD) in remissie. (11).

Secundaire doelstellingen zijn:

• Om het effect op de Pediatric Crohn Disease Activity Index (PCDAI) te bepalen
• om de tijd tot opflakkering van CD-pediatrische patiënten op VSL # 3 te bepalen in vergelijking met placebo
• om te beoordelen of gelijktijdige therapie met VSL # 3 de ernst van een opflakkering vermindert als deze optreedt
• om de veiligheid en verdraagbaarheid van therapie met VSL #3 bij hoge dosering bij pediatrische patiënten met CD te beoordelen

Studie ontwerp

Dit onderzoek zal een gerandomiseerde, dubbelblinde, placebogecontroleerde, cross-over studie zijn. De studie zal 30 kinderen met CD omvatten en zal in 6 maanden als volgt worden geformuleerd. Een groep van 10 vrijwillige gezonde kinderen, vergelijkbaar in leeftijd en geslacht, zal gebruikt worden als referentiegroep voor de analyse van het metabole profiel.

Deze kinderen zullen worden gerandomiseerd naar een behandelingsgroep die gedurende 2 maanden ofwel 1-2 pakjes met 900 miljard bacteriën/dag VSL#3 krijgt, afhankelijk van hun gewicht, en een groep die het placebo-medicijn krijgt. Toewijzing aan therapie of placebo zal worden bepaald volgens een door de computer gegenereerd randomisatieschema. De medicijnen worden bij elk bezoek door de onderzoeker verstrekt; naleving zal worden beoordeeld door geretourneerde tassen te tellen en de patiënten te ondervragen. Uitstekende therapietrouw wordt gedefinieerd als het niet overtreden van het protocol met betrekking tot de inname van de onderzoeksmedicatie. Na afloop van de 8 weken volgt een "wash-out"-periode van 6 weken waarin geen preparaat wordt toegediend. Daarna wordt elke patiënt overgeschakeld naar de andere groep en eveneens gedurende 8 weken gevolgd.

Alle patiënten zullen tijdens de onderzoeksperiode reguliere medicatie blijven gebruiken (al dan niet geassocieerd met 5-ASA met azathioprine).

Patiënten zullen klinisch worden beoordeeld bij baseline en elke 8 weken tot de voltooiing van de studie, na 24 weken of op het moment van recidief. Bij elk bezoek worden gegevens verzameld, waaronder patiëntvragenlijsten over ziekteactiviteit (ontlastingsfrequentie, ontlastingsconsistentie, hematochezie, buikpijn, extra-intestinale manifestaties van ziekte en algemeen functioneren van de patiënt). Aanvullende informatie die bij het eerste bezoek werd verzameld, omvatte demografische gegevens, familiegeschiedenis en het begin van de symptomen. Lichamelijk onderzoek zal bij elk bezoek door een kinderarts worden uitgevoerd en omvat een abdominaal onderzoek en onderzoek naar extra-intestinale manifestaties van CD. Routinematige bloedtesten voor coeliakie, cellobiose/mannitol onderzoek naar de permeabiliteit van de dunne darm, ontlastingsculturen, ontlastingscalprotectine, zullen worden uitgevoerd bij elk bezoek en/of op het moment van terugval. Urine zal worden verzameld voor de analyse van het metabole profiel met mono- en bidimensionale 1H NMR-spectroscopie met hoge resolutie. Bij 10 gezonde vrijwillige kinderen en patiënten werden galzuur, isoleucine, leucine, valine, 2-oxo-3-methylvaleriaanzuur, 2-oxo-isovaleriaanzuur, 2-methyl-3-hydroxyboterzuur, 3-hydroxybutyraat, 3-hydroxybutyraat, 3-hydroxyisovaleriaanzuur, threonine, lactaat, 3-hydroxymethylglutaminezuur, alanine, N-acetylasparagine + aspartylglutamaat + glutamilzuur, azijnzuur, carnitine, aceton, acetoacetaat, 2-hydroxyglutaraat, pyruvaat, glutaarzuur, N-acetylglutaminezuur, succinaat, 3-hydroxy-3-methylglucaric zuur, dimethylamine, sarcosine, N-acetyl-aspartyl-glutamaat, dimethylglycine, citroenzuur, creatine, creatinine, choline, betaïne, malonzuur, trimethylamineoxide, sarcosine, glycine, 1-methylhistidine, 3 -methylhistidine, benzoilglycine (hippurinezuur), N-methylbetaïne (trigonellina), arabinosio, uracil, guanosine, tyrosine, fenylalanine, xanthine, hypoxanthine, 3-methylhistidine zullen worden beoordeeld. Bovendien zullen bij kinderen met de ziekte van Crohn veel andere signalen van metabolieten worden verwacht, die het gevolg zijn van geneesmiddelen of andere verbindingen die als zodanig worden ingenomen of worden verwerkt door het metabolisme van het lichaam of de microbiële darmflora. de metabolomische analyse zal de evaluatie mogelijk maken van de volgende orgaanspecifieke en systemische processen op basis van laagmoleculaire verbindingen die een profiel opleveren van het metabolische systeem van de proefpersonen: intermediair metabolisme van suiker, mitochondriale citroenzuurcyclus, aminozuurmetabolisme, oxidatief metabolisme van vet zuur, afbraak en omzet van eiwitten, metabolisme van purine en pyrimidine, route van trans-methylering en trans-sulfide, metabolisme van darmbacteriën; enzovoort.

PCDAI en de globale beoordeling van een arts werden gebruikt om de ziekteactiviteit te meten. Geen ziekteactiviteit is gelijk aan een score van 0-10, milde ziekte is gelijk aan 11-30, matige/ernstige ziekte is gelijk aan 31 of meer. (10)

Bij baseline en na 24 weken ondergaan de patiënten ileocolonoscopie om de endoscopische en histologische activiteit van de ziekte te evalueren. Evaluatie van de microbiota op biopsieën en ontlastingsmonsters zal worden uitgevoerd tijdens ileocolonoscopieën met behulp van FISH (Fluorescentie In Situ Hybridisatie). Er zal een colonkweek worden uitgevoerd om alle cytokinen en chemokinen te evalueren door middel van een multiplexassay. Daarnaast zal de RNA-analyse van biopsieën worden uitgevoerd voor de studie van proteasoomsubeenheden of andere ontstekingsmarkers

Tijdens het onderzoek zullen aanvullende gegevens worden verzameld over de veiligheid en verdraagbaarheid van therapie met VSL #3.