Проспективное плацебо-контролируемое двойное слепое перекрестное исследование влияния пробиотического препарата (VSL#3) на метаболический профиль, кишечную проницаемость, микробиоту, экспрессию цитокинов и хемокинов и другие маркеры воспаления у педиатрических пациентов с болезнью Крона

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) в детском возрасте представляют собой хронические рецидивирующие и ремиттирующие воспалительные состояния, оказывающие значительное влияние на рост и развитие.

ВЗК включает переход от регулируемого иммунного ответа кишечника к такому, который обусловлен неограниченной активацией иммунных клеток и продуцированием провоспалительных цитокинов. (1) Причина этого усиления иммунной стимуляции представляет большой интерес, и несколько исследований указывают на роль комменсальных бактерий в прогрессировании заболевания. (2) Недавнее исследование сравнило микробиоту пациентов с ВЗК с микробиотой лиц без ВЗК и выявило значительную разницу в их составе. Микробиота пациентов с ВЗК показала аномальный микробный состав, характеризующийся истощением Firmicutes и Bacteroides, которые представлены в контрольной группе без ВЗК. (3)

Повышенная активность NF-κB вовлечена в патологию обеих форм ВЗК. Болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК). Изучен механизм протеасом-опосредованной активации NF-kB при БК и ЯК. Висекруна и др. продемонстрировали, что состав субъединиц и протеолитическая функция протеасом различаются при ЯК и БК. Высокая экспрессия субъединиц иммунопротеасом β1i и β2i характерна для воспаленной слизистой оболочки БК (4). В соответствии с этим они обнаружили усиленный процессинг предшественника NF-κB p105 и деградацию ингибитора NF-κB, IκBα, иммунопротеасомами, выделенными из слизистой оболочки пациентов с БК. По сравнению со здоровым контролем и пациентами с БК, пациенты с ЯК демонстрировали промежуточный фенотип в отношении опосредованного протеасомами процессинга/деградации компонентов NF-kB (4). Наконец, повышенная экспрессия члена семейства NF-kB c-Rel в воспаленной слизистой оболочке. пациентов с CD предполагает, что p50/c-Rel важен для IFN-γ-опосредованной индукции иммунопротеасом посредством IL-12-управляемых Th1-ответов. Эти данные свидетельствуют о том, что различные субъединицы протеасом влияют на интенсивность воспаления, опосредованного NF-kB, у пациентов с ВЗК (4).

В исследовании Pagnini C et al. авторы сообщают, что пробиотическая смесь VSL#3 предотвращает начало воспаления кишечника на модели CD-илеита у мышей SAMP. Эти эффекты были связаны с локальным воздействием на эпителий кишечника (т. е. стимуляция продукции TNF-α и активация NF-kB в эпителиальных клетках в сочетании с восстановлением нормальной барьерной функции кишечного эпителия).

Анализ бактериальной ДНК в стуле и слизистой оболочке подвздошной кишки мышей, получавших лечение, продемонстрировал значительное увеличение штаммов пробиотиков, что свидетельствует о том, что для положительного эффекта лечения пробиотиками необходима эффективная бактериальная колонизация. Это исследование поддерживает гипотезу о том, что пробиотики способствуют здоровью кишечника посредством механизма, включающего стимуляцию эпителиальных врожденных реакций (т. е. стимуляцию экспрессии TNF-α), а не подавление воспаления. (5)

В исследованиях на животных было показано, что многие отдельные виды бактерий или их комбинации облегчают симптомы ВЗК и уменьшают воспаление кишечника. Лечение мышей с колитом пробиотическим составом VSL#3 увеличивало продукцию IL-10 и процент Т-клеток, экспрессирующих TGFβ. Перенос мононуклеарных клеток собственной пластинки от мышей, получавших VSL#3, предотвращал колит у мышей-реципиентов, указывая на то, что VSL#3 может инициировать образование защитной популяции клеток. (6)

Недавнее выявление симбиотических бактерий с мощными противовоспалительными свойствами и их относительное отсутствие во время болезни предполагает, что определенные аспекты здоровья человека могут зависеть от состояния микробиоты. (7)

Кроме того, липополисахарид (ЛПС) является основным компонентом внешней мембраны бактерий, который в значительной степени отвечает за опосредование септического шока. В норме организм не реагирует на высокую концентрацию ЛПС, присутствующую в просвете кишечника. Кишечная щелочная фосфатаза (IAP), по-видимому, детоксифицирует LPS, гидролизуя его и поддерживая гомеостаз кишечника с комменсальной флорой. (8)

Пробиотики модулируют состав микробиоты кишечника. Глобальный анализ микрочипов и биоинформатики выявил усиление иммунного ответа, фагоцитарных и воспалительных путей, в которых доминирует повышение транскрипционных факторов Th1 у мышей IL10-KO. Мыши IL10-KO, которым перорально вводили пробиотик VSL#3, демонстрировали местно-специфическое подавление этих воспалительных путей, включая передачу сигналов TLR и связанных эффекторных путей, таких как передача сигналов Т-клеток, В-клеточных рецепторов. Что еще более важно, VSL#3 запускал активацию передачи сигналов PPAR, метаболизма липидов, азота, аминокислот и ксенобиотиков (9).

На самом деле неясно, как изменения микробного состава, вызванные VSL#3, влияют на состояние воспаления кишечника. Вполне возможно, что VSL#3 способствует присутствию защитных микроорганизмов, вероятно составляющих самого пробиотика, которые непосредственно влияют на врожденные реакции хозяина. Сообщалось, что VSL#3 модулирует барьерную функцию, проницаемость кишечника и врожденные функции организма-хозяина, которые, если их изменить, могут оказать сильное влияние на состояние колита. Было показано, что VSL#3 усиливает барьерную функцию за счет снижения проницаемости эпителия у мышей IL10_/_, что коррелирует со снижением воспаления кишечника. Другое недавнее исследование показало, что VSL#3 предотвращает развитие илеита у мышей SAMP1/YitFc за счет усиления барьерной функции эпителия и активации врожденной передачи сигналов, что приводит к активации NF-jB. Эти эффекты, по-видимому, опосредованы секретируемыми продуктами VSL#3. Это согласуется с сообщениями, показывающими, что факторы пробиотического происхождения способны модулировать реакции хозяина и экспериментальный колит. Кроме того, структурные компоненты, присутствующие в пробиотических бактериях, могут сильно влиять на иммунный ответ и способствовать выработке иммуносупрессивных молекул, таких как ИЛ-10 (10).

Цель:

Целью данного исследования является оценка влияния пробиотической композиции VSL#3 по сравнению с плацебо на метаболический профиль, проницаемость кишечника, микробиоту, экспрессию цитокинов и хемокинов и другие маркеры воспаления у детей с болезнью Крона (БК) в стадии ремиссии. (11).

Второстепенные цели:

• Для определения влияния на индекс активности болезни Крона у детей (PCDAI)
• определить время до обострения у педиатрических пациентов с болезнью Крона, получавших VSL#3, по сравнению с плацебо
• оценить, снижает ли сопутствующая терапия с VSL#3 тяжесть обострения, если оно возникает
• оценить безопасность и переносимость терапии VSL №3 в высоких дозах у детей с болезнью Крона.

Дизайн исследования

Это исследование будет рандомизированным, двойным слепым, плацебо-контролируемым, перекрестным. Исследование будет включать 30 детей с CD и будет сформулировано через 6 месяцев следующим образом. Группа из 10 здоровых детей-добровольцев, сопоставимых по возрасту и полу, будет использоваться в качестве контрольной группы для анализа метаболического профиля.

Эти дети будут рандомизированы в группу лечения, получающую в течение 2 месяцев либо 1-2 пакета, содержащих 900 миллиардов бактерий/день VSL#3, в зависимости от их веса, либо группу, получающую препарат плацебо. Назначение терапии или плацебо будет определяться в соответствии с созданной компьютером схемой рандомизации. Лекарства будут выдаваться исследователем при каждом посещении; соответствие будет оцениваться путем подсчета возвращенных пакетов и опроса пациентов. Отличное соблюдение будет определяться отсутствием нарушений протокола в отношении приема исследуемого препарата. По завершении 8 недель будет проведен период «вымывания» продолжительностью 6 недель, когда препарат не будет вводиться. Затем каждый пациент будет переведен в другую группу и будет наблюдаться аналогичным образом в течение следующих 8 недель.

Все пациенты будут продолжать регулярно принимать лекарства в течение всего периода исследования (азатиоприн связан или не связан с 5-АСК).

Пациенты будут оцениваться клинически на исходном уровне и каждые 8 ​​недель до завершения исследования, через 24 недели или во время рецидива. При каждом посещении будут собираться данные, включая анкеты пациентов относительно активности заболевания (частота стула, консистенция стула, гематохезия, боль в животе, внекишечные проявления заболевания и общее состояние пациента). Дополнительная информация, собранная при первом посещении, включала демографические данные, семейный анамнез и начало симптомов. Физикальное обследование будет проводиться при каждом посещении педиатром и включать осмотр брюшной полости и обследование на наличие внекишечных проявлений БК. Рутинные анализы крови на БК, исследование проницаемости тонкой кишки с целлобиозой/маннитолом, посев кала, кальпротектин кала будут выполняться при каждом посещении и/или во время рецидива. Моча будет собираться для анализа метаболического профиля с помощью моно- и двумерной спектроскопии 1H ЯМР высокого разрешения. У 10 здоровых детей-добровольцев и пациентов определяли желчные кислоты, изолейцин, лейцин, валин, 2-оксо-3-метилвалериановую кислоту, 2-оксо-изовалериановую кислоту, 2-метил-3-оксимасляную кислоту, 3-гидроксибутират, 3-гидроксибутират, 3-гидроксиизовалериановая кислота, треонин, лактат, 3-гидроксиметилглутаминовая кислота, аланин, N-ацетиласпарагин + аспартилглутамат + глутамиловая кислота, уксусная кислота, карнитин, ацетон, ацетоацетат, 2-гидроксиглутарат, пируват, глутаровая кислота, N-ацетилглутаминовая кислота, сукцинат, 3-гидрокси-3-метилглюкаровая кислота, диметиламин, саркозин, N-ацетиласпартилглутамат, диметилглицин, лимонная кислота, креатин, креатинин, холин, бетаин, малоновая кислота, триметиламиноксид, саркозин, глицин, 1-метилгистидин, 3 Будут оцениваться -метилгистидин, бензоилглицин (гиппуровая кислота), N-метилбетаин (тригонеллина), арабинозио, урацил, гуанозин, тирозин, фенилаланин, ксантин, гипоксантин, 3-метилгистидин. Кроме того, у детей с болезнью Крона можно ожидать многих других сигналов метаболитов, возникающих в результате приема лекарств или других соединений, принимаемых как таковые или перерабатываемых в результате метаболизма организма или кишечной микробной флоры. метаболический анализ позволит оценить следующие органоспецифические и системные процессы на основе низкомолекулярных соединений, обеспечивающих профиль метаболической системы испытуемых: промежуточный метаболизм сахаров, митохондриальный цикл лимонной кислоты, метаболизм аминокислот, окислительный метаболизм жиров кислоты, расщепление и оборот белков, метаболизм пуринов и пиримидинов, пути трансметилирования и транссульфидов, метаболизм кишечных бактерий; и т.д.

PCDAI и глобальная оценка врача использовались для измерения активности заболевания. Отсутствие активности заболевания соответствует баллу от 0 до 10, легкое заболевание равно 11-30, среднетяжелое/тяжелое заболевание равно 31 или более. (10)

На исходном уровне и через 24 недели пациентам будет проведена илеоколоноскопия для оценки эндоскопической и гистологической активности заболевания. Оценка микробиоты на биоптатах и ​​образцах стула будет проводиться во время илеоколоноскопии с использованием FISH (флуоресцентной гибридизации in situ). Будет проведена культура толстой кишки для оценки всех цитокинов и хемокинов с помощью мультиплексного анализа. Кроме того, будет проведен анализ РНК из биоптатов для изучения субъединиц протеасом или других маркеров воспаления.

В ходе исследования будут собраны дополнительные данные о безопасности и переносимости терапии с помощью VSL №3.