Prospektywne, kontrolowane placebo, podwójnie ślepe, krzyżowe badanie wpływu preparatu probiotycznego (VSL#3) na profil metaboliczny, przepuszczalność jelit, mikroflorę, ekspresję cytokin i chemokin oraz inne markery stanu zapalnego u dzieci i młodzieży z chorobą Leśniowskiego-Crohna

Nieswoiste zapalenia jelit (IBD) wieku dziecięcego są przewlekłymi, nawracającymi i ustępującymi stanami zapalnymi, które mają istotny wpływ na wzrost i rozwój.

IBD obejmuje przejście od regulowanej jelitowej odpowiedzi immunologicznej do takiej, która jest napędzana przez niepohamowaną aktywację komórek odpornościowych i wytwarzanie cytokin prozapalnych. (1) Przyczyna tego wzrostu stymulacji immunologicznej jest bardzo interesująca, a kilka badań wskazuje na rolę bakterii komensalnych w postępie choroby. (2) W niedawnym badaniu porównano mikroflorę pacjentów z nieswoistym zapaleniem jelit z mikrobiomem osób nie cierpiących na nieswoiste zapalenie jelit i wykazano istotną różnicę w ich składzie. Mikroflora pacjentów z IBD wykazywała nieprawidłowy skład drobnoustrojów charakteryzujący się wyczerpaniem Firmicutes i Bacteroides, które są reprezentowane w kontrolach innych niż IBD. (3)

Zwiększona aktywność NF-κB bierze udział w patologii obu postaci NZJ. Choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) i wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC). Zbadano mechanizm aktywacji NF-κB za pośrednictwem proteasomu w CD i UC. Visekruna i wsp. wykazali, że skład podjednostek i funkcja proteolityczna proteasomów różnią się między UC a CD. Wysoka ekspresja podjednostek immunoproteasomu β1i i β2i jest charakterystyczna dla zmienionej zapalnie błony śluzowej CD (4). Zgodnie z tym stwierdzili ulepszone przetwarzanie prekursora NF-κB p105 i degradację inhibitora NF-κB, IκBα, przez immunoproteasomy wyizolowane z błony śluzowej pacjentów z CD. W porównaniu ze zdrowymi kontrolami i pacjentami z CD, pacjenci z UC wykazywali pośredni fenotyp w odniesieniu do przetwarzania/degradacji składników NF-κB za pośrednictwem proteasomów (4). Wreszcie, zwiększona ekspresja członka rodziny NF-κB c-Rel w błonie śluzowej objętej stanem zapalnym pacjentów z CD sugeruje, że p50/c-Rel jest ważny dla pośredniczonej przez IFN-γ indukcji immunoproteasomów poprzez odpowiedzi Th1 kierowane przez IL-12. Odkrycia te sugerują, że różne podjednostki proteasomu wpływają na intensywność zapalenia, w którym pośredniczy NF-κB u pacjentów z IBD (4).

W badaniu Pagnini C i wsp. autorzy donoszą, że mieszanina probiotyczna VSL#3 zapobiega wystąpieniu zapalenia jelit w mysim modelu zapalenia jelita krętego SAMP. Efekty te były związane z miejscowym wpływem na nabłonek jelitowy (tj. stymulacją wytwarzania TNF-α i aktywacją NF-κB w komórkach nabłonka, w połączeniu z przywróceniem normalnej funkcji bariery nabłonkowej jelit).

Analiza bakteryjnego DNA w kale i błonie śluzowej jelita krętego leczonych myszy wykazała znaczny wzrost szczepów probiotycznych, co sugeruje, że skuteczna kolonizacja bakteryjna jest wymagana dla uzyskania korzystnych efektów leczenia probiotycznego. To badanie potwierdza hipotezę, że probiotyki promują zdrowie jelit poprzez mechanizm obejmujący stymulację wrodzonych odpowiedzi nabłonka (tj. stymulację ekspresji TNF-α), a nie tłumienie stanu zapalnego. (5)

W badaniach na zwierzętach wykazano, że wiele pojedynczych gatunków bakterii lub ich kombinacji łagodzi objawy IBD i zmniejsza zapalenie jelit. Leczenie myszy z zapaleniem okrężnicy preparatem probiotycznym VSL#3 zwiększyło wytwarzanie IL-10 i odsetek komórek T eksprymujących TGFβ. Przeniesienie jednojądrzastych komórek blaszki właściwej z myszy leczonych VSL#3 zapobiegało zapaleniu okrężnicy u myszy biorców, co wskazuje, że VSL#3 może inicjować wytwarzanie ochronnej populacji komórek. (6)

Niedawna identyfikacja bakterii symbiotycznych o silnych właściwościach przeciwzapalnych i ich skorelowana nieobecność podczas choroby sugeruje, że niektóre aspekty zdrowia ludzkiego mogą zależeć od stanu mikroflory. (7)

Ponadto lipopolisacharyd (LPS) jest głównym składnikiem zewnętrznej błony bakteryjnej, która jest w dużej mierze odpowiedzialna za pośrednictwo we wstrząsie septycznym. Normalnie organizm nie reaguje na wysokie stężenie LPS, które jest obecne w świetle jelita. Wydaje się, że jelitowa fosfataza alkaliczna (IAP) odtruwa LPS poprzez jego hydrolizę i utrzymywanie homeostazy jelitowej z florą komensalną. (8)

Probiotyki modulują skład mikroflory jelitowej. Globalna analiza mikromacierzy i bioinformatyki ujawniła wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej, szlaków fagocytarnych i zapalnych zdominowanych przez podwyższenie czynników transkrypcyjnych Th1 u myszy IL10-KO. Myszy IL10-KO, którym podawano doustnie probiotyk VSL#3, wykazywały specyficzną miejscowo regulację w dół tych szlaków zapalnych, w tym sygnalizacji TLR i pokrewnych szlaków efektorowych, takich jak sygnalizacja przez limfocyty T i receptory limfocytów B. Co ważniejsze, VSL#3 wywołał regulację w górę sygnalizacji PPAR, metabolizmu lipidów, azotu, aminokwasów i ksenobiotyków (9).

W rzeczywistości nie jest jasne, w jaki sposób wywołane VSL#3 zmiany w składzie mikrobiologicznym wpływają na stan zapalenia jelit. Możliwe, że VSL#3 promuje obecność ochronnych mikroorganizmów, prawdopodobnie składników samego probiotyku, które bezpośrednio wpływają na wrodzone reakcje gospodarza. Donoszono, że VSL#3 moduluje funkcję bariery, przepuszczalność jelit i wrodzone funkcje gospodarza, które, jeśli zostaną zmienione, mogą mieć głęboki wpływ na stan zapalenia okrężnicy. Wykazano, że VSL#3 wzmacnia funkcję barierową poprzez zmniejszenie przepuszczalności nabłonka u myszy IL10_/_, co koreluje ze zmniejszeniem stanu zapalnego jelit. Inne niedawne badanie wykazało, że VSL#3 zapobiega rozwojowi zapalenia jelita krętego u myszy SAMP1/YitFc poprzez wzmacnianie funkcji bariery nabłonkowej i aktywację wrodzonej sygnalizacji prowadzącej do aktywacji NF-jB. Efekty te wydają się być pośredniczone przez wydzielane produkty VSL#3. Jest to zgodne z doniesieniami wykazującymi, że czynniki pochodzenia probiotycznego są zdolne do modulowania odpowiedzi gospodarza i eksperymentalnego zapalenia jelita grubego. Ponadto składniki strukturalne obecne w bakteriach probiotycznych mogą głęboko wpływać na odpowiedź immunologiczną i sprzyjać wytwarzaniu cząsteczek immunosupresyjnych, takich jak IL-10 (10).

Zamiar:

Celem tego badania jest ocena wpływu preparatu probiotycznego VSL#3 w porównaniu z placebo na profil metaboliczny, przepuszczalność jelit, mikroflorę, ekspresję cytokin i chemokin oraz inne markery stanu zapalnego u pacjentów pediatrycznych z chorobą Leśniowskiego-Crohna (CD) w remisji (11).

Cele drugorzędne to:

• Aby określić wpływ na pediatryczny wskaźnik aktywności choroby Leśniowskiego-Crohna (PCDAI)
• w celu określenia czasu do zaostrzenia choroby u dzieci i młodzieży z CD na VSL#3 w porównaniu z placebo
• by ocenić czy współbieżna terapia z VSL#3 zmniejsza ciężkość zaostrzenia jeśli to wystąpi
• ocena bezpieczeństwa i tolerancji leczenia VSL #3 w wysokich dawkach u pacjentów pediatrycznych z CD

Projekt badania

To badanie będzie randomizowanym, podwójnie ślepym, kontrolowanym placebo badaniem krzyżowym. Badanie obejmie 30 dzieci z CD i zostanie sformułowane w ciągu 6 miesięcy w następujący sposób. Grupa 10 ochotników zdrowych dzieci, porównywalnych pod względem wieku i płci, zostanie wykorzystana jako grupa odniesienia do analizy profilu metabolicznego.

Te dzieci zostaną losowo przydzielone do grupy otrzymującej przez 2 miesiące albo 1-2 opakowania zawierające 900 miliardów bakterii dziennie VSL#3 zgodnie z ich wagą, albo do grupy otrzymującej lek placebo. Przypisanie do terapii lub placebo zostanie określone zgodnie z wygenerowanym komputerowo schematem randomizacji. Leki będą wydawane przez badacza podczas każdej wizyty; zgodność zostanie oceniona poprzez liczenie zwróconych toreb i przesłuchanie pacjentów. Doskonała zgodność zostanie zdefiniowana jako brak naruszenia protokołu w odniesieniu do przyjmowania badanego leku. Po zakończeniu 8 tygodni nastąpi okres „wymywania” trwający 6 tygodni, podczas którego nie będzie podawany żaden preparat. Następnie każdy pacjent zostanie przeniesiony do innej grupy i obserwowany podobnie przez kolejne 8 tygodni.

Wszyscy pacjenci będą kontynuować przyjmowanie regularnych leków przez cały okres badania (związany z azatiopryną lub nie z 5-ASA).

Pacjenci będą oceniani klinicznie na początku badania i co 8 tygodni aż do zakończenia badania, po 24 tygodniach lub w momencie nawrotu choroby. Podczas każdej wizyty zbierane będą dane, w tym kwestionariusze pacjentów dotyczące aktywności choroby (częstość stolca, konsystencja stolca, hematochezia, ból brzucha, pozajelitowe objawy choroby i ogólne funkcjonowanie pacjenta). Dodatkowe informacje zebrane podczas pierwszej wizyty obejmowały dane demograficzne, historię rodzinną i początek objawów. Badanie fizykalne będzie przeprowadzane podczas każdej wizyty przez pediatrę i obejmowało badanie jamy brzusznej oraz badanie pozajelitowych objawów CD. Rutynowe badania krwi w kierunku CD, badanie przepuszczalności jelita cienkiego celobiozy/mannitolu, posiewy kału, kalprotektyna w kale będą wykonywane podczas każdej wizyty i/lub w momencie nawrotu choroby. Mocz zostanie pobrany do analizy profilu metabolicznego za pomocą jedno- i dwuwymiarowej spektroskopii 1H NMR o wysokiej rozdzielczości. U 10 zdrowych ochotników i pacjentów kwas żółciowy, izoleucyna, leucyna, walina, kwas 2-okso-3-metylo-walerianowy, kwas 2-okso-izowalerianowy, kwas 2-metylo-3-hydroksymasłowy, 3-hydroksymaślan, 3-hydroksymaślan, kwas 3-hydroksyizowalerianowy, treonina, mleczan, kwas 3-hydroksymetyloglutaminowy, alanina, N-acetyloasparagina + glutaminian aspartylu + kwas glutamilowy, kwas octowy, karnityna, aceton, acetooctan, 2-hydroksyglutaran, pirogronian, kwas glutarowy, kwas N-acetyloglutaminowy, bursztynian, kwas 3-hydroksy-3-metyloglukarowy, dimetyloamina, sarkozyna, N-acetylo-aspartylo-glutaminian, dimetyloglicyna, kwas cytrynowy, kreatyna, kreatynina, cholina, betaina, kwas malonowy, trimetyloaminotlenek, sarkozyna, glicyna, 1-metylohistydyna, 3 -metylohistydyna, benzoilglicyna (kwas hipurowy), N-metylobetaina (trigonellina), arabinosio, uracyl, guanozyna, tyrozyna, fenyloalanina, ksantyna, hipoksantyna, 3-metylohistydyna. Ponadto u dzieci z CD można spodziewać się wielu innych sygnałów metabolitów, wynikających z leków lub innych związków przyjmowanych jako takie lub przetwarzanych przez metabolizm organizmu lub florę bakteryjną jelit. analiza metaboliczna pozwoli na ocenę następujących procesów narządowych i ogólnoustrojowych w oparciu o niskocząsteczkowe związki dające profil układu metabolicznego badanych: pośredni metabolizm cukru, mitochondrialny cykl kwasu cytrynowego, metabolizm aminokwasów, oksydacyjny metabolizm tłuszczów kwas, rozkład i obrót białek, metabolizm puryn i pirymidyn, szlaki trans-metylacji i trans-siarczków, metabolizm bakterii jelitowych; itp.

Do pomiaru aktywności choroby wykorzystano PCDAI i ogólną ocenę lekarza. Żadna aktywność choroby nie równa się punktacji 0-10, łagodna choroba równa się 11-30, umiarkowana/ciężka choroba równa się 31 lub więcej. (10)

Na początku badania iw 24. tygodniu pacjenci zostaną poddani ileokolonoskopii w celu oceny endoskopowej i histologicznej aktywności choroby. Ocena mikrobiomu na biopsjach i próbkach kału zostanie przeprowadzona w czasie ileokolonoskopii przy użyciu metody FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). Zostanie przeprowadzona hodowla okrężnicy w celu oceny wszystkich cytokin i chemokin za pomocą testu multipleksowego. Ponadto zostanie przeprowadzona analiza RNA z biopsji do badania podjednostek proteasomu lub innych markerów stanu zapalnego

Podczas badania zostaną zebrane dodatkowe dane dotyczące bezpieczeństwa i tolerancji terapii VSL #3.