泌尿生殖器腫瘍における潜在的な治療効果 (Avatar)

序章

1. 表現型評価モデル

   1874 年、ウィリアム ロバーツとジョン ティンダルは、寒天プレート上での細胞増殖の阻害を観察しました。 1940 年代に、ヒートリーは抗菌溶液を含むろ紙ディスクの使用を提案し、「ラジアル ディスク法」を導入しました。

   WHO は 1975 年に方法論と参照法に関する報告書を発表し、臨床検査基準の国際基準をサポートしています。 抗生物質治療に対する微生物の表現型応答は、コロニーの増殖を比較することで、本明細書で提案されている腫瘍治療応答表現型プラットフォーム (患者由来の腫瘍アバター) に理論的根拠を提供する可能性があります。

2. 患者由来の異種移植片（PDX）におけるがん治療

   個別化された治療法を提案するには、宿主によって異なる腫瘍治療反応の表現型を知る必要があります。 異種移植片を使用した研究は、特定の薬物に対する反応を予測するために使用されています。

3. 漿尿膜

絨毛尿膜 (CAM) アッセイは、in vivo での抗腫瘍薬試験のための高速で再現性のある方法として使用されています。 このアッセイは、血管新生の研究に広く使用されており、胚のリンパ系が完全に発達していないため、泌尿生殖器腫瘍を含む異種移植腫瘍モデルでの開発にも成功しています。 新しい技術が研究され、その結果、新しいプロトコルが生成されました。 CAM の異種移植モデルの主な課題は、卵を除去した後の胚の死亡率が比較的高く、死亡率が 25 ～ 50% であることです。

彼らは好ましい血管新生環境を提示するため、ニワトリの卵が使用されます。 卵子の受精から 8 日後の CAM の成長後、血管へのアクセスが非常に容易になり、血管の操作と観察が可能になります。 これにより、複雑ながん研究を行うことができる方法でシステムと細胞を維持することができます.

血管は、同種移植片および異種移植片の発達に栄養を与えることに加えて、血管内侵入および腫瘍細胞の播種に特有の支持環境を再定義しました。

CAM は高度に血管化されているため、タンパク質などの他の要因に加えて、腫瘍移植の豊富な媒体になります。 このサポートは、腫瘍細胞の浸潤、播種、および血管新生に限定されることになります。

腫瘍の異質性が高いため、泌尿生殖器腫瘍の治療はまだ個別化されていません。 患者が受ける治療の選択は、個別化された治療の文脈に移したときに不備を示す集団研究によって定義されます。

細胞培養とオルガノイドは、適用する単純なモデルであり、低コストで迅速な結果が得られます。 しかし、この方法を腫瘍の研究に適用すると、結果は腫瘍の環境条件を表すものではなく、細胞の成長と治療パターンへの反応を妨げる適応を強制します。 したがって、異種移植片モデルは文化のいくつかの制限を克服するため、フレームワークはその開発のためにしっかりしています。 対照的に、異種移植プロトコルの作成はより複雑になりますが、自然環境における癌のより代表的な方法です。 CAM は、in-ovo と ex-ovo の 2 つのストランドで研究されました。 卵内研究では、プロトコルは卵殻を切断することによって公開されました。

ex-ovo 研究は、CAM と胚のアクセシビリティを改善し、その文書化と操作を可能にすることに焦点を当てています。

最近、外因性CAM異種移植モデルを使用して、腎腫瘍と薬剤耐性との相関関係が説明されました。 これにより、特に血管新生と腫瘍の研究に関して、他の側面が監視、研究、改善されます。

仮説

患者とがんの多様性が治療における主な課題であるという証拠が増えています。これは、絨毛尿膜腫瘍 (CTA) プラットフォーム/アバターを使用して、治療に対する反応の表現型に関する情報を提供できる臨床ツールの検索を正当化するものです。

臨床現場ですでに確立されているアンチバイオグラムが細菌の抗生物質に対する感受性を予測しているように、がんの転帰、生活の質、および費用対効果に潜在的な利益をもたらす個別化された治療の余地があります。

絨毛尿膜の腫瘍アバターは臨床診療を変革する可能性があるため、治療応答表現型プラットフォームを使用して、泌尿生殖器がんの各患者に最適な治療法 (「腫瘍ケモグラム」) を定義および予測します。

目的

• 一次播種が失敗した場合の戦略として、新鮮（即時）および凍結組織の播種の効率を-80度（24時間および48時間）で検証する。
• 提案されたプラットフォームでの新生物組織の安定性とその特性（ゲノム、プロテオミクス、代謝、表現型）の維持を評価する。
• 異種移植片における泌尿生殖器癌の治療に対する反応表現型を評価すること。
• 提案されたプラットフォームの実装が個別化された治療に与える影響、その費用、および泌尿生殖器癌患者における結果 (腫瘍学的および機能的) を調査すること。

提案された方法論

各病院の患者からの泌尿生殖器腫瘍の 30 の生検を含む前向き観察研究。 各生検では、1 ～ 2 mm2 の最大 12 個の腫瘍外植片が生成され、1 個のニワトリ胚の漿尿膜に個別に移植され、10 個の提案された薬と 2 個の対照卵がテストされます。

したがって、生検ごとに 12 個の胚が必要になります。 同意後の患者の泌尿生殖器原発腫瘍の生検は、「Hospital das Clínicas da Unicamp」および「Hospital Municipal de Paulínia」によって提供されます。

材料を収集し、培養液 (McCoy) に入れ、切除後 24 時間以内に氷上に保管します。 組織片の一部は、さらなる研究のために急速に凍結され、-80℃で保存されます。

前回の試みが失敗した場合の救助の種まきのために、理想的な冷蔵条件で安全なサンプルが予約されます。 サンプルは可能な限り次のように分割されます。

• 新鮮な腫瘍: ミトコンドリアアッセイ、培養、ウエスタンブロット
• 腫瘍形態: 組織病理学、免疫組織化学
• 腫瘍培養: 漿尿膜、凍結 腫瘍生検移植片の場合、胚が 8 ～ 10 日齢のときに CAM が使用されます。

まず、鉗子を使って CAM 層を穏やかに破裂させ、次に腫瘍の生検を血管の Y 字型分岐点の近くに配置します。 腫瘍を配置した後、汚染を防ぐために 200ul の PBS を配置します。 移植片が CAM の血管新生と接触した後、腫瘍の成長を 3 ～ 4 日間監視します。

このプロセスは評価され、腫瘍の増殖がある場合、システムは治療段階に進みます。 腫瘍の増殖があったため、胚生後17日目から治療を行います。 使用される治療は、シスプラチン、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドキソルビシン、カルボプラチン、パゾパニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、メトトレキサート、およびビンブラスチンの用量です。 薬物の濃度のために、それらは腫瘍領域のろ紙の隣に配置されます。 この治療には 3 ～ 4 日かかります。その後、各薬剤の可能性を判断するために分析が行われます。

胚の安楽死は、すでに開発された痛みのシステムを持っているため (CEUA 4874-1 / 2018 を承認したプロトコルに従って) 断頭によって発生します。

取り付けられた移植片の周りの CAM をはさみで切り取り、PBS を入れたペトリ皿に移します。 余分な CAM は除去され、組織病理学、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング、ミトコンドリア評価によって分析される移植片のみが残ります。

リスク

この研究への参加に伴うリスクは最小限であり、研究対象の治療に干渉はなく、実験室で使用するために提出される手術で回収された材料のごく一部を使用するだけです病気についてさらに知るために、必要に応じて、結果の可能性が最も高い将来の治療法を具体的に特定します。

利点

この研究により、研究対象者が受けている現在の治療 (その時点で利用可能な最良の標準治療) のどの側面も変更することなく、将来の治療の選択に潜在的な利益をもたらす疾患に関するより深い知識が得られます。

データ分析方法論

一元配置分散分析と事後ボンフェローニ検定を使用して、原発性腫瘍群と異種移植片で培養されたものとの比較を行う。 スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡ反復測定（ボンフェローニ事後検定）を用いてデータを分析する。 有意水準は、Prism 5 (GraphPad ソフトウェア) を使用して 0.05 未満として定義されます。

主な結果

• プラットフォームの効率 (腫瘍取り込み率)
• プラットフォームの代表性 (新鮮な腫瘍と培養された腫瘍の類似性)

副次的転帰

• さまざまな治療オプションに対する腫瘍反応表現型の定義。
• 個別化された治療に対する提案されたプラットフォームの実装の影響、その費用と結果 (腫瘍学的および機能的)