Mögliche therapeutische Reaktion bei Urogenitaltumoren (Avatar)

Einführung

1. Phänotypisches Bewertungsmodell

   1874 beobachteten William Roberts und John Tyndall die Hemmung des Zellwachstums auf der Agarplatte. In den 1940er Jahren schlug Heatley die Verwendung von Filterpapierscheiben vor, die antimikrobielle Lösungen enthielten, und führte die "radiale Scheibenmethode" ein.

   Die WHO veröffentlichte 1975 einen Bericht über die Methodik und die Referenzmethode, die den internationalen Standard der klinischen Laborstandards unterstützen. Die phänotypische Reaktion von Mikroorganismen auf eine Antibiotikabehandlung, die die Proliferation von Kolonien vergleicht, könnte eine Begründung für die hier vorgeschlagene Phänotypplattform für die Tumorbehandlungsreaktion (von Patienten stammender Tumor-Avatar) bieten.

2. Krebsbehandlung mit von Patienten stammenden Xenotransplantaten (PDX)

   Um eine individualisierte Behandlung vorzuschlagen, ist es notwendig, den Phänotyp des Ansprechens auf die Tumorbehandlung zu kennen, der je nach Wirt variiert. Studien mit Xenotransplantaten werden verwendet, um eine Reaktion auf bestimmte Medikamente vorherzusagen.

3. Chorioallantoismembran

Der Chorioallantoismembran (CAM)-Assay wurde als schnelles, reproduzierbares Verfahren zum Testen von Antitumor-Arzneimitteln in vivo verwendet. Dieser Assay wurde weithin für die Untersuchung der Angiogenese verwendet und wurde auch erfolgreich in einem Xenotransplantat-Tumormodell entwickelt, einschließlich Urogenitaltumoren, aufgrund der völligen Nichtentwicklung des lymphatischen Systems des Embryos. Die neuen Techniken wurden untersucht, wodurch folglich neue Protokolle generiert wurden. Die größte Herausforderung für das Xenograft-Modell bei CAM ist ein relativ häufiges Auftreten von embryonalem Tod nach der Eizellentnahme mit einer Sterblichkeitsrate zwischen 25 und 50 %.

Die Hühnereier werden verwendet, da sie eine günstige Vaskularisationsumgebung darstellen. Nach dem Wachstum der CAM, also nach 8 Tagen Eizellbefruchtung, wird der Zugang zu den Blutgefäßen stark erleichtert, wodurch sie manipuliert und beobachtet werden können. Dadurch ist es in der Lage, Systeme und Zellen so zu erhalten, dass komplexe Krebsstudien durchgeführt werden können.

Blutgefäße nähren nicht nur die Entwicklung von Allo- und Xenotransplantaten, sondern definieren auch eine unterstützende Umgebung neu, die für die Intravasation und Verbreitung von Tumorzellen einzigartig ist.

Die CAM ist stark vaskularisiert, was sie neben anderen Faktoren wie Proteinen zu einem reichhaltigen Medium für die Tumorimplantation macht. Diese Unterstützung ist schließlich ausschließlich für die Invasion, Verbreitung und Vaskularisierung von Tumorzellen.

Die Behandlung von Urogenitaltumoren ist aufgrund der hohen Heterogenität der Tumoren noch nicht individualisiert. Die Wahl der Behandlung, die der Patient erhält, wird durch Bevölkerungsstudien definiert, die bei der Übertragung auf den Kontext der individualisierten Behandlung Unzulänglichkeiten aufweisen.

Die Zellkultur und Organoide sind ein einfach anzuwendendes Modell mit niedrigen Kosten und schnellen Ergebnissen. Wenn das Verfahren jedoch auf die Untersuchung von Tumoren angewendet wird, stellen die Ergebnisse keine Umgebungsbedingungen des Tumors dar, was die Zellen zu einer Anpassung zwingt, die ihr Wachstum und ihre Reaktion auf Behandlungsmuster stört. Somit überwinden die Xenografts-Modelle einige Beschränkungen der Kultur, so dass der Rahmen für ihre Entwicklung solide ist. Im Gegensatz dazu wird die Erstellung eines Xenografts-Protokolls komplexer, aber es ist eine repräsentativere Methode für Krebs in seiner natürlichen Umgebung. CAM wurde mit zwei Strängen untersucht, in-ovo und ex-ovo. Für In-Ovo-Studien wurde das Protokoll durch Schneiden von Eierschalen freigelegt.

Die Ex-Ovo-Studien konzentrieren sich darauf, die Zugänglichkeit der CAM und des Embryos zu verbessern und ihre Dokumentation und Manipulation zu ermöglichen.

Kürzlich wurde eine Korrelation zwischen Nierentumoren und Arzneimittelresistenz unter Verwendung eines exogenen CAM-Xenotransplantatmodells beschrieben. Dies führt dazu, dass andere Aspekte überwacht, untersucht und verbessert werden, insbesondere in Bezug auf die Angiogenese und die Forschung mit Tumoren.

Hypothese

Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass die Vielfalt des Patienten und des Krebses die größte Herausforderung bei ihrer Behandlung darstellen, was die Suche nach einem klinischen Werkzeug rechtfertigt, das Informationen über den Phänotyp des Ansprechens auf die Behandlung unter Verwendung der Chorioallantois-Tumor (CTA)-Plattform/Avatar liefern kann.

So wie das bereits in der klinischen Praxis etablierte Antibiogramm die Empfindlichkeit von Bakterien gegenüber Antibiotika antizipiert, gibt es Raum für eine individualisierte Behandlung mit potenziellem Nutzen in Bezug auf Krebsergebnisse, Lebensqualität und Kosteneffizienz.

Definition und Antizipation der besten Behandlung ("Tumor-Chemogramm") für jeden Patienten mit Urogenitalkrebs unter Verwendung der Phänotyp-Plattform für das Ansprechen auf die Behandlung, da der Tumor-Avatar in der Chorioallantoismembran die klinische Praxis verändern kann.

Ziele

• Überprüfung der Wirksamkeit der Aussaat von frischem (sofortigem) und gefrorenem Gewebe bei -80 Grad (in 24 und 48 h) als Strategie bei Fehlschlagen der primären Aussaat;
• Bewertung der Stabilität des neoplastischen Gewebes und der Aufrechterhaltung seiner Eigenschaften (genomisch, proteomisch, metabolisch und phänotypisch) in der vorgeschlagenen Plattform;
• Bewertung des Reaktionsphänotyps auf die Behandlung von Urogenitalkarzinomen in Xenotransplantaten.
• Untersuchung der Auswirkungen der vorgeschlagenen Plattformimplementierung auf die individualisierte Behandlung, ihre Kosten und Ergebnisse (onkologisch und funktionell) bei Patienten mit Urogenitalkarzinomen.

Vorgeschlagene Methodik

Eine prospektive Beobachtungsstudie mit 30 Biopsien von Urogenitaltumoren von Patienten der jeweiligen Kliniken. Jede Biopsie erzeugt bis zu 12 Tumorexplantate von 1 bis 2 mm2, die einzeln in die Chorioallantoismembran von 1 Hühnerembryo implantiert werden, um die 10 vorgeschlagenen Medikamente plus 2 Kontroll-Eier zu testen.

Daher werden für jede Biopsie 12 Embryonen benötigt. Biopsien von urogenitalen Primärtumoren von Patienten werden nach Einwilligung gesammelt, bereitgestellt vom "Hospital das Clínicas da Unicamp" und "Hospital Municipal de Paulínia".

Das Material wird gesammelt und in Kulturmedium (McCoy) gegeben und innerhalb von 24 Stunden nach der Resektion auf Eis gehalten. Ein Teil der Gewebefragmente wird für weitere Untersuchungen schnell eingefroren und bei -80 °C gelagert.

Es wird ein Sicherheitsmuster unter idealen Kühlbedingungen für eine Rettungsaussaat im Falle des Scheiterns des vorherigen Versuchs reserviert. Die Proben werden nach Möglichkeit aufgeteilt in:

• Frischer Tumor: mitochondrialer Assay, Kultur, Western Blot
• Tumorformol: Histopathologie, Immunhistochemie
• Tumorkultur: Chorioallantoismembran, gefroren Für das Tumorbiopsietransplantat wird die CAM verwendet, wenn die Embryonen 8 bis 10 Tage alt sind.

Zuerst wird die CAM-Schicht mit Hilfe einer Pinzette sanft aufgerissen, dann wird die Biopsie des Tumors in der Nähe einer Y-förmigen Bifurkation eines Blutgefäßes platziert. Nach Platzierung des Tumors werden 200 ul PBS platziert, um eine Kontamination zu verhindern. Nachdem das Transplantat mit der Vaskularisierung der CAM in Kontakt gekommen ist, wird das Tumorwachstum in einem Zeitraum von 3 bis 4 Tagen überwacht.

Dieser Prozess wird ausgewertet und bei Tumorwachstum geht das System in die Behandlungsphase über. Da es zu Tumorwachstum gekommen ist, werden die Behandlungen ab dem 17. Tag nach dem Embryo durchgeführt. Die verwendeten Behandlungen sind Dosen der folgenden Arzneimittel: Cisplatin, Gemcitabin, Paclitaxel, Doxorubicin, Carboplatin, Pazopanib, Sunitinib, Sorafenib, Methotrexat und Vinblastin. Zur Konzentration der Medikamente werden sie neben dem Filterpapier in den Tumorregionen platziert. Diese Behandlung dauert 3 bis 4 Tage, danach werden Analysen durchgeführt, um das Potenzial jedes Medikaments zu bestimmen.

Die Euthanasie des Embryos erfolgt durch Enthauptung (gemäß dem genehmigten Protokoll CEUA 4874-1 / 2018), da er bereits über ein entwickeltes Schmerzsystem verfügt.

Scherenschnitt durch die CAM um das befestigte Transplantat, übertragen auf eine Petrischale mit PBS. Der Überschuss an CAM wird dann entfernt, wobei nur das Transplantat zur Analyse durch Histopathologie, Immunhistochemie, Western-Blotting und mitochondriale Bewertung übrig bleibt.

Risiken

Die mit der Teilnahme an dieser Studie verbundenen Risiken sind minimal, da es keine Eingriffe in die Behandlung des Forschungsgegenstands gibt, sondern nur die Verwendung eines kleinen Teils des in der Operation entnommenen Materials, das zur Verwendung im Labor archiviert wird um noch mehr über die Krankheit zu erfahren, ggf. zukünftige Behandlungen mit den besten Erfolgsaussichten gezielt zu identifizieren.

Vorteile

Diese Studie wird ein besseres Wissen über die Krankheit mit potenziellem Nutzen bei der Wahl zukünftiger Behandlungen ermöglichen, ohne irgendeinen Aspekt der aktuellen Behandlung zu verändern, die die Forschungsperson erhält (die derzeit beste verfügbare Standardbehandlung).

Methodik der Datenanalyse

Vergleiche zwischen Primärtumorgruppen und kultivierten in Xenotransplantaten werden unter Verwendung von Einweg-ANOVA mit dem Post-hoc-Bonferroni-Test durchgeführt. Die Daten werden unter Verwendung von Student-t-Tests oder wiederholten ANOVA-Messungen (Bonferroni-Post-Hoc-Test) analysiert. Das Signifikanzniveau wird unter Verwendung von Prism 5 (GraphPad-Software) als kleiner als 0,05 definiert.

Primäre Ergebnisse

• Plattformeffizienz (Tumoraufnahme in Prozent)
• Repräsentativität der Plattform (Ähnlichkeit zwischen frischem und kultiviertem Tumor)

Sekundäre Ergebnisse

• Definition des Phänotyps des Ansprechens des Tumors auf verschiedene therapeutische Optionen.
• Auswirkungen der vorgeschlagenen Plattformimplementierung auf die individualisierte Behandlung, ihre Kosten und Ergebnisse (onkologisch und funktionell)