Respuesta terapéutica potencial en tumores urogenitales (Avatar)

Introducción

1. Modelo de evaluación fenotípica

   En 1874, William Roberts y John Tyndall observaron la inhibición del crecimiento celular en la placa de agar. En la década de 1940, Heatley sugirió el uso de discos de papel de filtro que contenían soluciones antimicrobianas e introdujo el "método de disco radial".

   La OMS publicó un informe sobre la metodología y el método de referencia en 1975, que respaldan el estándar internacional de estándares de laboratorio clínico. La respuesta fenotípica de los microorganismos al tratamiento con antibióticos, comparando la proliferación de colonias podría ofrecer una justificación para la plataforma de fenotipo de respuesta al tratamiento tumoral propuesta en el presente documento (avatar tumoral derivado del paciente).

2. Tratamiento del cáncer en xenoinjertos derivados del paciente (PDX)

   Para plantear un tratamiento individualizado es necesario conocer el fenotipo de respuesta al tratamiento del tumor, que varía según el huésped. Los estudios que usan xenoinjertos se están utilizando para predecir una respuesta a ciertos medicamentos.

3. Membrana corioalantoidea

El ensayo de membrana corioalantoidea (CAM) se ha utilizado como un método rápido y reproducible para la prueba de fármacos antitumorales in vivo. Este ensayo se ha utilizado ampliamente para el estudio de la angiogénesis y también se ha desarrollado con éxito en un modelo de tumor de xenoinjerto, incluidos los tumores urogenitales, debido a la falta total de desarrollo del sistema linfoide del embrión. Las nuevas técnicas han sido estudiadas, generando en consecuencia nuevos protocolos. El principal desafío para el modelo de xenoinjerto en CAM es una incidencia relativamente alta de muerte embrionaria después de la extracción del óvulo, con una tasa de mortalidad de entre el 25 y el 50 %.

Los huevos de pollito se utilizarán porque presentan un ambiente de vascularización favorable. Tras el crecimiento de la CAM, que es a los 8 días de la fecundación del óvulo, se facilita mucho el acceso a los vasos sanguíneos, lo que hace que sean manipulados y observados. Esto lo hace capaz de sostener sistemas y células de la misma manera que se pueden realizar estudios complejos de cáncer.

Los vasos sanguíneos, además de nutrir el desarrollo de aloinjertos y xenoinjertos, redefinieron un entorno de apoyo único para la intravasación y diseminación de células tumorales.

La CAM está muy vascularizada, lo que la convierte en un medio rico para la implantación tumoral, además de otros factores como las proteínas. Este apoyo acaba siendo exclusivo de la invasión, diseminación y vascularización de las células tumorales.

El tratamiento de los tumores genitourinarios aún no está individualizado, debido a la alta heterogeneidad de los tumores. La elección del tratamiento que recibirá el paciente está definida por estudios poblacionales que presentan insuficiencias cuando se trasladan al contexto del tratamiento individualizado.

El cultivo celular y los organoides son un modelo sencillo de aplicar, de bajo coste y rápidos resultados. Sin embargo, cuando el método se aplica al estudio de tumores, los resultados no representan las condiciones ambientales del tumor, obligando a las células a una adaptación que interfiere con su crecimiento y patrones de respuesta a los tratamientos. Así los modelos de xenoinjertos superan algunas restricciones de la cultura para que el marco sea sólido para su desarrollo. Por el contrario, la creación de un protocolo de xenoinjertos se vuelve más compleja, pero es un método más representativo del cáncer en su entorno natural. CAM se estudió con dos cadenas, in-ovo y ex-ovo. Para los estudios in ovo, el protocolo se expuso cortando la cáscara de huevo.

Los estudios ex-ovo se centran en mejorar la accesibilidad de la CAM y el embrión, posibilitando su documentación y manipulación.

Recientemente se ha descrito una correlación entre los tumores renales y la resistencia a fármacos utilizando un modelo de xenoinjerto CAM exógeno. Esto hace que se sigan, estudien y mejoren otros aspectos, especialmente en lo que respecta a la angiogénesis y la investigación con tumores.

Hipótesis

Cada vez hay más evidencia de que la diversidad del paciente y del cáncer representan el principal reto en su tratamiento, lo que justifica la búsqueda de una herramienta clínica capaz de proporcionar información sobre el fenotipo de respuesta al tratamiento mediante la plataforma/avatar de tumor corioalantoideo (CTA).

Así como el antibiograma ya establecido en la práctica clínica anticipa la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos, hay espacio para un tratamiento individualizado con beneficio potencial en los resultados del cáncer, la calidad de vida y la rentabilidad.

Definir y anticipar el mejor tratamiento ("quimiograma tumoral") para cada paciente con cáncer urogenital utilizando la plataforma de fenotipo de respuesta al tratamiento, ya que el avatar tumoral en la membrana corioalantoidea puede transformar la práctica clínica.

Objetivos

• Verificar la eficiencia de la siembra de tejido fresco (inmediato) y congelado -80 grados (en 24 y 48h) como estrategia en casos de falla de siembra primaria;
• Evaluar la estabilidad del tejido neoplásico y el mantenimiento de sus características (genómicas, proteómicas, metabólicas y fenotípicas) en la plataforma propuesta;
• Evaluar el fenotipo de respuesta al tratamiento de carcinomas urogenitales en xenoinjerto.
• Explorar el impacto de la implementación de la plataforma propuesta en el tratamiento individualizado, su costo y resultados (oncológicos y funcionales) en pacientes con carcinomas urogenitales.

Metodología propuesta

Estudio observacional prospectivo que incluye 30 biopsias de tumores urogenitales de pacientes de los respectivos hospitales. Cada biopsia generará hasta 12 explantes tumorales de 1 a 2 mm2, que se implantarán individualmente en la membrana corioalantoidea de 1 embrión de pollo para probar los 10 fármacos propuestos, más 2 óvulos de control.

Por lo tanto, se necesitarán 12 embriones para cada biopsia. Se recolectarán biopsias de tumores primarios urogenitales de pacientes previo consentimiento, proporcionados por el "Hospital das Clínicas da Unicamp" y el "Hospital Municipal de Paulínia".

El material será recolectado y colocado en medio de cultivo (McCoy) y mantenido en hielo dentro de las 24 horas posteriores a la resección. Parte de los fragmentos de tejido se congelarán rápidamente y se almacenarán a -80oC para estudios posteriores.

Se reservará una muestra de seguridad en condiciones ideales de refrigeración para una siembra de rescate en casos de fracaso del intento anterior. Las muestras se dividirán cuando sea posible en:

• Tumor fresco: ensayo mitocondrial, cultivo, western blot
• Formol tumoral: histopatología, inmunohistoquímica
• Cultivo tumoral: membrana corioalantoidea, congelada Para el injerto de biopsia tumoral se utilizará la CAM cuando los embriones tengan entre 8 y 10 días.

Primero, la capa CAM se romperá suavemente con la ayuda de unas pinzas, luego la biopsia del tumor se colocará cerca de una bifurcación en forma de Y de un vaso sanguíneo. Después de la colocación del tumor, se colocarán 200 ul de PBS para evitar la contaminación. Luego de que el injerto entre en contacto con la vascularización de la CAM, se monitoreará el crecimiento tumoral en un período de 3 a 4 días.

Este proceso será evaluado y si hay crecimiento tumoral el sistema pasará a la fase de tratamiento. Dado que hubo crecimiento tumoral, los tratamientos se realizarán a partir de los 17 días posteriores al embrión. Los tratamientos utilizados serán dosis de los siguientes medicamentos: cisplatino, gemcitabina, paclitaxel, doxorrubicina, carboplatino, pazopanib, sunitinib, sorafenib, metotrexato y vinblastina. Para la concentración de los fármacos, se colocarán junto al papel filtro en las regiones tumorales. Este tratamiento tomará de 3 a 4 días, luego de lo cual se realizarán análisis para determinar la potencialidad de cada fármaco.

La eutanasia del embrión se producirá por decapitación (según protocolo aprobado CEUA 4874-1/2018) dado que ya cuenta con un sistema de dolor desarrollado.

Corte con tijera a través de la CAM alrededor del injerto adjunto, transferido a una placa de Petri con PBS. Luego se eliminará el exceso de CAM, dejando solo el injerto para ser analizado por histopatología, inmunohistoquímica, transferencia Western y evaluación mitocondrial.

Riesgos

Los riesgos involucrados en la participación de este estudio son mínimos, ya que no hay interferencia en el tratamiento del tema de la investigación, solo el uso de una pequeña parte del material retirado en la cirugía que será archivado para ser utilizado en el laboratorio. para saber aún más sobre la enfermedad, identificar específicamente los tratamientos futuros con las mejores posibilidades de resultados si es necesario.

Beneficios

Este estudio permitirá un mayor conocimiento de la enfermedad con un potencial beneficio en la elección de futuros tratamientos, sin alterar ningún aspecto del tratamiento actual que está recibiendo el sujeto de investigación (el mejor tratamiento estándar disponible en ese momento).

Metodología de análisis de datos

Las comparaciones entre los grupos de tumores primarios frente a los cultivados en xenoinjertos se realizarán mediante ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Bonferroni. Los datos se analizarán utilizando pruebas t de Student o ANOVA de medidas repetidas (prueba post hoc de Bonferroni). El nivel de significación se definirá como inferior a 0,05 utilizando Prism 5 (software GraphPad).

Resultados primarios

• Eficiencia de la plataforma (toma tumoral en porcentaje)
• Representatividad de la plataforma (similitud entre tumor fresco y cultivado)

Resultados secundarios

• Definición del fenotipo de respuesta tumoral a las diferentes opciones terapéuticas.
• Impacto de la implantación de la plataforma propuesta en el tratamiento individualizado, su coste y resultados (oncológicos y funcionales)