Mahdollinen terapeuttinen vaste urogenitaalisissa kasvaimissa (Avatar)

Johdanto

1. Fenotyyppinen arviointimalli

   Vuonna 1874 William Roberts ja John Tyndall havaitsivat solujen kasvun estymisen agarmaljalla. 1940-luvulla Heatley ehdotti antimikrobiaalisia liuoksia sisältävien suodatinpaperilevyjen käyttöä ja esitteli "radiaalilevymenetelmän".

   WHO julkaisi vuonna 1975 raportin metodologiasta ja vertailumenetelmästä, jotka tukevat kansainvälistä Clinical Laboratory Standards -standardia. Mikro-organismien fenotyyppivaste antibioottihoidolle, pesäkkeiden lisääntymisen vertaaminen, saattaa tarjota perusteluja tässä ehdotetulle kasvainhoitovasteen fenotyyppialustalle (potilaasta peräisin oleva kasvain avatar).

2. Syövän hoito potilasperäisillä ksenografteilla (PDX)

   Yksilöllisen hoidon ehdottamiseksi on tarpeen tietää kasvainhoitovasteen fenotyyppi, joka vaihtelee isännästä riippuen. Ksenografteja käyttäviä tutkimuksia käytetään tiettyjen lääkkeiden vasteen ennustamiseen.

3. Korioallantoinen kalvo

Chorioallantoic membraani (CAM) -määritystä on käytetty nopeana, toistettavana menetelmänä kasvainlääkkeiden testaamiseen in vivo. Tätä määritystä on käytetty laajalti angiogeneesin tutkimuksessa, ja sitä on myös kehitetty menestyksekkäästi ksenograft-kasvainmallissa, mukaan lukien urogenitaaliset kasvaimet, koska alkion lymfoidijärjestelmä ei ole täysin kehittynyt. Uusia tekniikoita on tutkittu, minkä seurauksena on luotu uusia protokollia. Suurin haaste ksenograftimallille CAM:ssa on suhteellisen korkea alkiokuoleman esiintyminen munasolun poistamisen jälkeen, kuolleisuusasteella 25-50 %.

Kananmunia käytetään, koska ne tarjoavat suotuisan verisuonittumisympäristön. CAM:n kasvun jälkeen, joka on 8 päivän munahedelmöityksen jälkeen, pääsy verisuoniin helpottuu suuresti, jolloin niitä voidaan manipuloida ja tarkkailla. Tämän ansiosta se pystyy ylläpitämään järjestelmiä ja soluja tavalla, jolla monimutkaisia ​​syöpätutkimuksia voidaan tehdä.

Verisuonet sen lisäksi, että se ruokkii -allon ja ksenograftien kehittymistä, se määritteli uudelleen tukevan ympäristön, joka on ainutlaatuinen kasvainsolujen intravasaatiolle ja leviämiselle.

CAM on erittäin verisuonittunut, mikä tekee siitä rikkaan kasvualustan kasvaimen implantaatioon muiden tekijöiden, kuten proteiinien, lisäksi. Tämä tuki päätyy yksinomaan kasvainsolujen tunkeutumiseen, leviämiseen ja vaskularisaatioon.

Urogenitaalisten kasvainten hoito ei ole vielä yksilöllistä kasvainten suuren heterogeenisyyden vuoksi. Potilaan saaman hoidon valinta määräytyy populaatiotutkimuksilla, jotka osoittavat riittämättömyyttä siirrettäessä yksilöllisen hoidon kontekstiin.

Soluviljelmä ja organoidit ovat helppokäyttöinen malli, jolla on alhaiset kustannukset ja nopeat tulokset. Kuitenkin, kun menetelmää sovelletaan kasvainten tutkimukseen, tulokset eivät edusta kasvainympäristön olosuhteita, mikä pakottaa solut mukautumaan, mikä häiritsee niiden kasvua ja vastetta hoitokuvioihin. Siten ksenograftimallit ylittävät joitain kulttuurin rajoituksia, joten puitteet ovat vakaat sen kehitykselle. Sitä vastoin ksenograftiprotokollan luomisesta tulee monimutkaisempaa, mutta se on edustavampi menetelmä syöpää varten sen luonnollisessa ympäristössä. CAM:ia tutkittiin kahdella osa-alueella, in-ovo ja ex-ovo. In-ovo-tutkimuksissa protokolla paljastettiin leikkaamalla munankuori.

Ex ovo -tutkimukset keskittyvät CAM:n ja alkion saavutettavuuden parantamiseen, mikä mahdollistaa sen dokumentoinnin ja manipuloinnin.

Äskettäin on kuvattu munuaisten kasvainten ja lääkeresistenssin välinen korrelaatio käyttämällä eksogeenistä CAM-ksenograftimallia. Tämä saa aikaan muita näkökohtia, joita seurataan, tutkitaan ja parannetaan, erityisesti mitä tulee angiogeneesiin ja kasvaimien tutkimukseen.

Hypoteesi

On yhä enemmän näyttöä siitä, että potilaiden ja syövän monimuotoisuus ovat heidän hoidonsa suurin haaste, mikä oikeuttaa sellaisen kliinisen työkalun etsimisen, joka pystyy tarjoamaan tietoa hoitovasteen fenotyypistä käyttämällä korioallantoiskasvaimen (CTA) alustaa/avataria.

Kuten kliinisessä käytännössä jo vakiintunut antibiogrammi ennakoi bakteerien herkkyyttä antibiooteille, on olemassa tilaa yksilölliselle hoidolle, joka voi parantaa syövän tuloksia, elämänlaatua ja kustannustehokkuutta.

Paras hoito ("kasvainkemogrammi") määritetään ja ennakoidaan kullekin urogenitaalisyöpäpotilaalle käyttämällä hoitovasteen fenotyyppialustaa, koska kasvaimen avatar korioallantoiskalvossa voi muuttaa kliinistä käytäntöä.

Tavoitteet

• Tuoreen (välittömän) ja pakastetun kudoksen kylvötehokkuuden tarkistaminen -80 astetta (24 ja 48 tunnin aikana) strategiana ensikylvön epäonnistuessa;
• Arvioida neoplastisen kudoksen stabiilius ja sen ominaisuuksien (genominen, proteominen, metabolinen ja fenotyyppinen) säilyminen ehdotetulla alustalla;
• Arvioida vastefenotyyppi urogenitaalisten karsinoomien hoitoon ksenograftissa.
• Tutkia ehdotetun alustan toteutuksen vaikutusta yksilölliseen hoitoon, sen kustannuksia ja tuloksia (onkologisia ja toiminnallisia) potilailla, joilla on urogenitaaliset karsinoomat.

Ehdotettu menetelmä

Prospektiivinen havainnointitutkimus, johon sisältyi 30 biopsiaa urogenitaalisista kasvaimista vastaavien sairaaloiden potilailta. Jokainen biopsia tuottaa jopa 12 kasvaineksplanttia, joiden koko on 1-2 mm2, jotka istutetaan yksittäin 1 kanan alkion korioallantoiskalvolle 10 ehdotetun lääkkeen ja 2 kontrollimunan testaamiseksi.

Siksi jokaista biopsiaa varten tarvitaan 12 alkiota. "Hospital das Clínicas da Unicamp" ja "Hospital Municipal de Paulínia" keräävät potilaiden urogenitaalisten primaaristen kasvainten biopsiat suostumuksen saatuaan.

Materiaali kerätään ja asetetaan elatusaineeseen (McCoy) ja pidetään jäissä 24 tunnin sisällä resektiosta. Osa kudosfragmenteista jäädytetään nopeasti ja säilytetään -80 oC:ssa jatkotutkimuksia varten.

Se varataan turvanäyte ihanteellisissa jäähdytysolosuhteissa pelastuksen kylvöä varten, jos edellinen yritys epäonnistuu. Näytteet jaetaan mahdollisuuksien mukaan seuraavasti:

• Tuore kasvain: mitokondriomääritys, viljely, Western blot
• Kasvainformol: histopatologia, immunohistokemia
• Kasvainviljelmä: korioallantoinen kalvo, jäädytetty Kasvainbiopsian siirrettä varten CAM:ia käytetään, kun alkiot ovat 8–10 päivän ikäisiä.

Ensin CAM-kerros murretaan varovasti pihdeillä, sitten kasvaimen biopsia asetetaan lähelle verisuonen Y-muotoista haarautumaa. Kasvaimen sijoittamisen jälkeen asetetaan 200 ui PBS:ää kontaminaation estämiseksi. Sen jälkeen, kun siirrännäinen on kosketuksissa CAM:n vaskularisaatioon, kasvaimen kasvua seurataan 3-4 päivän ajan.

Tämä prosessi arvioidaan ja jos kasvain kasvaa, järjestelmä siirtyy hoitovaiheeseen. Koska kasvain kasvoi, hoidot suoritetaan 17 päivän kuluttua alkiosta. Käytetyt hoidot ovat seuraavien lääkkeiden annoksia: sisplatiini, gemsitabiini, paklitakseli, doksorubisiini, karboplatiini, patsopanibi, sunitinibi, sorafenibi, metotreksaatti ja vinblastiini. Lääkkeiden väkevöintiä varten ne sijoitetaan suodatinpaperin viereen kasvainalueille. Tämä hoito kestää 3–4 päivää, minkä jälkeen suoritetaan analyysit kunkin lääkkeen potentiaalin määrittämiseksi.

Alkion eutanasia tapahtuu katkaisemalla (CEUA 4874-1 / 2018 hyväksytyn protokollan mukaan), koska sillä on jo kehittynyt kipujärjestelmä.

Saksi leikattiin CAM:n läpi kiinnitetyn siirteen ympäriltä, ​​siirrettiin petrimaljalle PBS:n kanssa. Ylimääräinen CAM poistetaan sitten, jolloin vain siirrännäinen analysoidaan histopatologialla, immunohistokemialla, Western blottauksella ja mitokondrioiden arvioinnilla.

Riskit

Tähän tutkimukseen osallistumiseen liittyvät riskit ovat minimaaliset, koska tutkimuskohteen hoitoon ei puututa, vain pieni osa leikkauksessa vedetystä materiaalista, joka toimitetaan käytettäväksi laboratoriossa. saadaksesi vielä enemmän tietoa taudista, määritä tarvittaessa erityisesti tulevat hoidot, joilla on parhaat mahdollisuudet saada tuloksia.

Edut

Tämä tutkimus mahdollistaa paremman tietämyksen taudista ja mahdollistaa hyödyn tulevien hoitojen valinnassa muuttamatta mitään nykyisen hoidon näkökohtaa, jota tutkittavana saa (paras saatavilla oleva standardihoito tuolloin).

Tietojen analysointimenetelmät

Primaaristen kasvainryhmien ja ksenograftissa viljeltyjen ryhmien vertailut suoritetaan käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa post hoc Bonferroni -testin kanssa. Tiedot analysoidaan Studentin t-testeillä tai ANOVA-toistetuilla mittauksilla (Bonferroni post hoc -testi). Prism 5:llä (GraphPad-ohjelmisto) merkitsevyystasoksi määritetään alle 0,05.

Ensisijaiset tulokset

• Alustan tehokkuus (kasvaimen kasvu prosentteina)
• Alustan edustavuus (samankaltaisuus tuoreen ja viljellyn kasvaimen välillä)

Toissijaiset tulokset

• Tuumorivasteen fenotyypin määrittely erilaisille hoitovaihtoehdoille.
• Ehdotetun alustan toteutuksen vaikutus yksilölliseen hoitoon, sen kustannuksiin ja tuloksiin (onkologinen ja toiminnallinen)