Potenziale risposta terapeutica nei tumori urogenitali (Avatar)

introduzione

1. Modello di valutazione fenotipica

   Nel 1874, William Roberts e John Tyndall osservarono l'inibizione della crescita cellulare sulla piastra di agar. Negli anni '40 Heatley suggerì l'uso di dischi di carta da filtro contenenti soluzioni antimicrobiche e introdusse il "metodo del disco radiale".

   L'OMS ha pubblicato un rapporto sulla metodologia e sul metodo di riferimento nel 1975, che supportano lo standard internazionale dei Clinical Laboratory Standards. La risposta fenotipica dei microrganismi al trattamento antibiotico, confrontando la proliferazione delle colonie, potrebbe offrire una spiegazione razionale alla piattaforma fenotipica di risposta al trattamento del tumore qui proposta (avatar tumorale derivato dal paziente).

2. Trattamento del cancro su xenotrapianti derivati ​​​​dal paziente (PDX)

   Per proporre un trattamento individualizzato, è necessario conoscere il fenotipo della risposta al trattamento del tumore, che varia a seconda dell'ospite. Gli studi che utilizzano xenotrapianti vengono utilizzati per prevedere una risposta a determinati farmaci.

3. Membrana corioallantoidea

Il test della membrana corioallantoica (CAM) è stato utilizzato come metodo rapido e riproducibile per il test dei farmaci antitumorali in vivo. Questo test è stato ampiamente utilizzato per lo studio dell'angiogenesi ed è stato anche sviluppato con successo in un modello di tumore xenotrapianto, compresi i tumori urogenitali, a causa del totale mancato sviluppo del sistema linfoide dell'embrione. Le nuove tecniche sono state studiate, generando di conseguenza nuovi protocolli. La principale sfida per il modello di xenotrapianto nella CAM è un'incidenza relativamente elevata di morte embrionale dopo la rimozione dell'uovo, con un tasso di mortalità compreso tra il 25 e il 50%.

Verranno utilizzate le uova di pulcino perché presentano un ambiente di vascolarizzazione favorevole. Dopo la crescita della CAM, ovvero dopo 8 giorni dalla fecondazione dell'uovo, l'accesso ai vasi sanguigni è molto facilitato, costringendoli a essere manipolati e osservati. Ciò lo rende in grado di sostenere sistemi e cellule nel modo in cui è possibile condurre studi complessi sul cancro.

I vasi sanguigni, oltre a nutrire lo sviluppo di -allo e xenotrapianti, hanno ridefinito un ambiente di supporto unico per l'intravasazione e la diffusione delle cellule tumorali.

Il CAM è altamente vascolarizzato, il che lo rende un mezzo ricco per l'impianto del tumore, oltre ad altri fattori come le proteine. Questo supporto finisce per essere esclusivo per l'invasione, la disseminazione e la vascolarizzazione delle cellule tumorali.

Il trattamento dei tumori genitourinari non è ancora individualizzato, a causa dell'elevata eterogeneità dei tumori. La scelta del trattamento che il paziente riceverà è definita da studi di popolazione che presentano inadeguatezze quando trasferite nel contesto del trattamento individualizzato.

La coltura cellulare e gli organoidi sono un modello semplice da applicare, a basso costo e con risultati rapidi. Tuttavia, quando il metodo viene applicato allo studio dei tumori, i risultati non rappresentano le condizioni dell'ambiente tumorale, costringendo le cellule a un adattamento che interferisce con la loro crescita e la risposta ai modelli di trattamento. Così i modelli xenotrapianti superano alcune restrizioni della cultura in modo che il quadro sia solido per il suo sviluppo. Al contrario, la creazione di un protocollo di xenotrapianti diventa più complessa, ma è un metodo più rappresentativo del cancro nel suo ambiente naturale. La CAM è stata studiata con due filamenti, in-ovo ed ex-ovo. Per gli studi in-ovo, il protocollo è stato esposto tagliando il guscio d'uovo.

Gli studi ex-ovo si concentrano sul miglioramento dell'accessibilità della CAM e dell'embrione, consentendone la documentazione e la manipolazione.

Recentemente è stata descritta una correlazione tra tumori renali e resistenza ai farmaci utilizzando il modello di xenotrapianto CAM esogeno. Questo fa sì che altri aspetti vengano monitorati, studiati e migliorati, soprattutto per quanto riguarda l'angiogenesi e la ricerca sui tumori.

Ipotesi

Vi è una crescente evidenza che la diversità del paziente e il cancro rappresentano la sfida principale nel loro trattamento, il che giustifica la ricerca di uno strumento clinico in grado di fornire informazioni sul fenotipo di risposta al trattamento utilizzando la piattaforma/avatar del tumore corioallantoico (CTA).

Proprio come l'antibiogramma già stabilito nella pratica clinica anticipa la suscettibilità dei batteri agli antibiotici, c'è spazio per un trattamento individualizzato con potenziali benefici sugli esiti del cancro, sulla qualità della vita e sul rapporto costo-efficacia.

Definire e anticipare il miglior trattamento ("chemiogramma tumorale") per ogni paziente con cancro urogenitale utilizzando la piattaforma del fenotipo di risposta al trattamento, in quanto l'avatar del tumore nella membrana corioallantoidea può trasformare la pratica clinica.

Obiettivi

• Verificare l'efficacia della semina di tessuti freschi (immediati) e congelati -80 gradi (in 24 e 48h) come strategia nei casi di mancata semina primaria;
• Valutare la stabilità del tessuto neoplastico e il mantenimento delle sue caratteristiche (genomiche, proteomiche, metaboliche e fenotipiche) nella piattaforma proposta;
• Valutare il fenotipo di risposta al trattamento dei carcinomi urogenitali in xenotrapianto.
• Esplorare l'impatto dell'implementazione della piattaforma proposta sul trattamento individualizzato, il suo costo e i risultati (oncologici e funzionali) nei pazienti con carcinomi urogenitali.

Metodologia proposta

Uno studio osservazionale prospettico comprendente 30 biopsie di tumori urogenitali da pazienti dei rispettivi ospedali. Ogni biopsia genererà fino a 12 espianti tumorali da 1 a 2 mm2, che verranno impiantati individualmente sulla membrana corioallantoidea di 1 embrione di pollo per testare i 10 farmaci proposti, più 2 uova di controllo.

Saranno quindi necessari 12 embrioni per ogni biopsia. Saranno raccolte biopsie di tumori primitivi urogenitali di pazienti dopo il consenso, fornite dall '"Hospital das Clínicas da Unicamp" e "Hospital Municipal de Paulínia".

Il materiale sarà raccolto e posto in terreno di coltura (McCoy) e conservato in ghiaccio entro 24 ore dalla resezione. Parte dei frammenti di tessuto saranno rapidamente congelati e conservati a -80°C per ulteriori studi.

Sarà riservato un campione di sicurezza in condizioni ideali di refrigerazione per una semina di soccorso in caso di fallimento del tentativo precedente. I campioni saranno suddivisi ove possibile in:

• Tumore fresco: saggio mitocondriale, coltura, western blot
• Formolo tumorale: istopatologia, immunoistochimica
• Coltura del tumore: membrana corioallantoidea, congelata Per l'innesto della biopsia tumorale, il CAM verrà utilizzato quando gli embrioni avranno 8-10 giorni di età.

In primo luogo, lo strato CAM verrà rotto delicatamente con l'ausilio di una pinza, quindi la biopsia del tumore verrà posizionata vicino a una biforcazione a forma di Y di un vaso sanguigno. Dopo il posizionamento del tumore, verranno posizionati 200 ul di PBS per prevenire la contaminazione. Dopo che l'innesto entra in contatto con la vascolarizzazione della CAM, la crescita del tumore verrà monitorata in un periodo di 3-4 giorni.

Questo processo sarà valutato e se c'è crescita tumorale il sistema passerà alla fase di trattamento. Poiché c'è stata una crescita tumorale, i trattamenti verranno eseguiti a partire da 17 giorni dopo l'embrione. I trattamenti utilizzati saranno dosi dei seguenti farmaci: cisplatino, gemcitabina, paclitaxel, doxorubicina, carboplatino, pazopanib, sunitinib, sorafenib, metotrexato e vinblastina. Per la concentrazione dei farmaci, verranno posizionati accanto alla carta da filtro nelle regioni tumorali. Questo trattamento richiederà dai 3 ai 4 giorni, dopodiché verranno effettuate le analisi per determinare la potenzialità di ciascun farmaco.

L'eutanasia dell'embrione avverrà per decapitazione (secondo il protocollo approvato CEUA 4874-1/2018) poiché ha già un sistema del dolore sviluppato.

Taglio a forbice attraverso il CAM attorno all'innesto attaccato, trasferito in una capsula di Petri con PBS. L'eccesso di CAM verrà quindi rimosso, lasciando solo l'innesto da analizzare mediante istopatologia, immunoistochimica, western blotting e valutazione mitocondriale.

Rischi

I rischi connessi alla partecipazione a questo studio sono minimi, in quanto non vi è alcuna interferenza nel trattamento dell'oggetto della ricerca, solo l'utilizzo di una piccola parte del materiale prelevato in chirurgia che verrà archiviato per essere utilizzato in laboratorio per conoscere ancora di più la malattia, identificare in modo specifico i trattamenti futuri con le migliori possibilità di risultati, se necessario.

Benefici

Questo studio consentirà una maggiore conoscenza della malattia con un potenziale beneficio nella scelta di trattamenti futuri, senza alterare alcun aspetto del trattamento attuale che il soggetto della ricerca sta ricevendo (il miglior trattamento standard disponibile al momento).

Metodologia di analisi dei dati

I confronti tra gruppi tumorali primari rispetto a quelli coltivati ​​in xenotrapianto saranno eseguiti utilizzando ANOVA unidirezionale con il test post hoc di Bonferroni. I dati saranno analizzati utilizzando test t di Student o misure ripetute ANOVA (test post hoc di Bonferroni). Il livello di significatività sarà definito come inferiore a 0,05 utilizzando Prism 5 (software GraphPad).

Risultati primari

• Efficienza della piattaforma (prelievo del tumore in percentuale)
• Rappresentatività della piattaforma (somiglianza tra tumore fresco e coltivato)

Esiti secondari

• Definizione del fenotipo di risposta del tumore alle diverse opzioni terapeutiche.
• Impatto dell'implementazione della piattaforma proposta sul trattamento individualizzato, sui suoi costi e risultati (oncologici e funzionali)