Potencial Resposta Terapêutica em Tumores Urogenitais (Avatar)

Introdução

1. Modelo de avaliação fenotípica

   Em 1874, William Roberts e John Tyndall observaram a inibição do crescimento celular na placa de ágar. Na década de 1940, Heatley sugeriu o uso de discos de papel filtro contendo soluções antimicrobianas e introduziu o "método do disco radial".

   A OMS divulgou um relatório sobre a metodologia e o método de referência em 1975, que apóiam o padrão internacional de Padrões de Laboratórios Clínicos. A resposta fenotípica de microorganismos ao tratamento com antibióticos, comparando a proliferação de colônias, pode oferecer uma justificativa para a plataforma de fenótipo de resposta ao tratamento tumoral aqui proposta (avatar do tumor derivado do paciente).

2. Tratamento de câncer em xenoenxertos derivados de pacientes (PDX)

   Para propor um tratamento individualizado, é necessário conhecer o fenótipo de resposta do tumor ao tratamento, que varia de acordo com o hospedeiro. Estudos usando xenoenxertos estão sendo usados ​​para prever uma resposta a certos medicamentos.

3. Membrana Corioalantoica

O ensaio de membrana corioalantóica (CAM) tem sido usado como um método rápido e reprodutível para testes de drogas antitumorais in vivo. Este ensaio tem sido amplamente utilizado para o estudo da angiogênese e também foi desenvolvido com sucesso em um modelo de tumor de xenoenxerto, incluindo tumores urogenitais, devido ao não desenvolvimento total do sistema linfoide do embrião. As novas técnicas têm sido estudadas, gerando conseqüentemente novos protocolos. O maior desafio para o modelo de xenoenxerto em CAM é uma ocorrência relativamente alta de morte embrionária após a remoção do ovo, com uma taxa de mortalidade entre 25 e 50%.

Os ovos de galinha serão utilizados por apresentarem um ambiente de vascularização favorável. Após o crescimento da CAM, que ocorre após 8 dias da fertilização do óvulo, o acesso aos vasos sanguíneos é muito facilitado, fazendo com que sejam manipulados e observados. Isso o torna capaz de sustentar sistemas e células da mesma forma que estudos complexos de câncer podem ser feitos.

Os vasos sanguíneos, além de nutrir o desenvolvimento de -allo e xenoenxertos, redefiniram um ambiente de suporte exclusivo para intravasamento e disseminação de células tumorais.

A CAM é altamente vascularizada, o que a torna um meio rico para implantação tumoral, além de outros fatores como proteínas. Esse suporte acaba sendo exclusivo da invasão, disseminação e vascularização das células tumorais.

O tratamento dos tumores geniturinários ainda não é individualizado, devido à alta heterogeneidade dos tumores. A escolha do tratamento que o paciente receberá é definida por estudos populacionais que apresentam inadequações quando transferidas para o contexto do tratamento individualizado.

A cultura de células e organoides é um modelo simples de ser aplicado, possuindo baixo custo e resultados rápidos. Porém, quando o método é aplicado ao estudo de tumores, os resultados não representam as condições do ambiente tumoral, obrigando as células a uma adaptação que interfere em seu crescimento e resposta aos padrões de tratamentos. Assim os modelos de xenoenxertos superam algumas restrições da cultura para que o arcabouço seja sólido para seu desenvolvimento. Em contraste, a criação de um protocolo de xenoenxertos torna-se mais complexa, mas é um método mais representativo do câncer em seu ambiente natural. A CAM foi estudada com duas vertentes, in-ovo e ex-ovo. Para estudos in-ovo, o protocolo foi exposto cortando a casca do ovo.

Os estudos ex-ovo visam melhorar a acessibilidade do CAM e do embrião, possibilitando sua documentação e manipulação.

Recentemente, foi descrita uma correlação entre tumores renais e resistência a drogas usando modelo de xenoenxerto CAM exógeno. Isso faz com que outros aspectos sejam acompanhados, estudados e aprimorados, principalmente no que se refere à angiogênese e à pesquisa com tumores.

Hipótese

Há evidências crescentes de que a diversidade do paciente e o câncer representam o principal desafio em seu tratamento, o que justifica a busca por uma ferramenta clínica capaz de fornecer informações sobre o fenótipo de resposta ao tratamento utilizando a plataforma/avatar do tumor corioalantóide (CTA).

Assim como o antibiograma já estabelecido na prática clínica antecipa a suscetibilidade das bactérias aos antibióticos, há espaço para tratamento individualizado com potencial benefício nos desfechos oncológicos, qualidade de vida e custo-efetividade.

Definir e antecipar o melhor tratamento ("quimiograma tumoral") para cada paciente com câncer urogenital usando a plataforma de fenótipo de resposta ao tratamento, pois o avatar do tumor na membrana corioalantóide pode transformar a prática clínica.

Objetivos

• Verificar a eficiência da semeadura de tecido fresco (imediato) e congelado -80 graus (em 24 e 48h) como estratégia nos casos de falha da semeadura primária;
• Avaliar a estabilidade do tecido neoplásico e a manutenção de suas características (genômica, proteômica, metabólica e fenotípica) na plataforma proposta;
• Avaliar o fenótipo de resposta ao tratamento de carcinomas urogenitais em xenoenxertos.
• Explorar o impacto da implementação da plataforma proposta no tratamento individualizado, seu custo e resultados (oncológicos e funcionais) em pacientes com carcinomas urogenitais.

Metodologia Proposta

Um estudo observacional prospectivo incluindo 30 biópsias de tumores urogenitais de pacientes dos respectivos hospitais. Cada biópsia gerará até 12 explantes tumorais de 1 a 2 mm2, que serão implantados individualmente na membrana corioalantóide de 1 embrião de galinha para testar as 10 drogas propostas, mais 2 ovos controle.

Portanto, serão necessários 12 embriões para cada biópsia. Serão coletadas biópsias de tumores primários urogenitais de pacientes após consentimento, fornecidas pelo "Hospital das Clínicas da Unicamp" e "Hospital Municipal de Paulínia".

O material será colhido e colocado em meio de cultura (McCoy) e mantido em gelo até 24 horas após a ressecção. Parte dos fragmentos de tecido será rapidamente congelada e armazenada a -80oC para estudos posteriores.

Será reservada uma amostra de segurança em condições ideais de refrigeração para uma semeadura de resgate em casos de falha da tentativa anterior. As amostras serão divididas sempre que possível em:

• Tumor fresco: ensaio mitocondrial, cultura, western blot
• Tumor formol: histopatologia, imuno-histoquímica
• Cultura do tumor: membrana corioalantóide, congelada Para o enxerto da biópsia do tumor, o CAM será usado quando os embriões estiverem com 8 a 10 dias de idade.

Primeiro, a camada CAM será rompida suavemente com o auxílio de uma pinça, em seguida, a biópsia do tumor será colocada perto de uma bifurcação em forma de Y de um vaso sanguíneo. Após a colocação do tumor, serão colocados 200ul de PBS para evitar contaminação. Após o contato do enxerto com a vascularização da CAM, o crescimento do tumor será acompanhado em um período de 3 a 4 dias.

Esse processo será avaliado e caso haja crescimento do tumor o sistema irá para a fase de tratamento. Como houve crescimento tumoral, os tratamentos serão realizados a partir de 17 dias após o embrião. Os tratamentos utilizados serão as doses dos seguintes medicamentos: cisplatina, gemcitabina, paclitaxel, doxorrubicina, carboplatina, pazopanibe, sunitinibe, sorafenibe, metotrexato e vinblastina. Para a concentração das drogas, elas serão colocadas próximas ao papel filtro nas regiões tumorais. Este tratamento levará de 3 a 4 dias, após os quais serão realizadas análises para determinar a potencialidade de cada medicamento.

A eutanásia do embrião ocorrerá por decapitação (conforme protocolo aprovado CEUA 4874-1/2018) desde que já possua um sistema de dor desenvolvido.

Corte com tesoura através do CAM ao redor do enxerto anexado, transferido para uma placa de Petri com PBS. O excesso de CAM será então removido, deixando apenas o enxerto para análise histopatológica, imuno-histoquímica, western blotting e avaliação mitocondrial.

riscos

Os riscos envolvidos na participação deste estudo são mínimos, pois não há interferência no tratamento do sujeito da pesquisa, apenas a utilização de uma pequena parte do material retirado na cirurgia que ficará arquivado para ser utilizado no laboratório para saber ainda mais sobre a doença, especificamente identificar tratamentos futuros com melhores chances de resultados, se necessário.

Benefícios

Este estudo permitirá um maior conhecimento da doença com potencial benefício na escolha de tratamentos futuros, sem alterar nenhum aspecto do tratamento atual que o sujeito da pesquisa está recebendo (o melhor tratamento padrão disponível no momento).

Metodologia de Análise de Dados

Comparações entre grupos de tumores primários versus cultivados em xenoenxerto serão realizadas usando ANOVA de uma via com o teste post hoc de Bonferroni. Os dados serão analisados ​​por meio de testes t de Student ou medidas repetidas ANOVA (teste post hoc de Bonferroni). O nível de significância será definido como menor que 0,05 usando o Prism 5 (software GraphPad).

Resultados primários

• Eficiência da plataforma (porcentagem de absorção do tumor)
• Representatividade da plataforma (semelhança entre tumor fresco e cultivado)

Resultados secundários

• Definição do fenótipo de resposta do tumor a diferentes opções terapêuticas.
• Impacto da implementação da plataforma proposta no tratamento individualizado, seu custo e resultados (oncológicos e funcionais)