Potenciální terapeutická odezva u urogenitálních nádorů (Avatar)

Úvod

1. Model fenotypového hodnocení

   V roce 1874 William Roberts a John Tyndall pozorovali inhibici růstu buněk na agarové plotně. Ve 40. letech 20. století navrhl Heatley použití filtračních papírových disků obsahujících antimikrobiální roztoky a zavedl „metodu radiálního disku“.

   WHO vydala v roce 1975 zprávu o metodice a referenční metodě, které podporují mezinárodní standard klinických laboratorních standardů. Fenotypová odpověď mikroorganismů na léčbu antibiotiky, porovnání proliferace kolonií, může nabídnout zdůvodnění zde navrhované platformy fenotypu odpovědi na léčbu nádoru (avatar nádoru odvozeného od pacienta).

2. Léčba rakoviny na xenoimplantátech odvozených od pacienta (PDX)

   Pro navržení individualizované léčby je nutné znát fenotyp odpovědi na léčbu nádoru, který se u hostitele liší. Studie využívající xenografty se používají k predikci odpovědi na určité léky.

3. Chorioalantoická membrána

Test chorioalantoické membrány (CAM) byl použit jako rychlá, reprodukovatelná metoda pro testování protinádorových léčiv in vivo. Tento test byl široce používán pro studium angiogeneze a byl také úspěšně vyvinut v modelu xenograftového tumoru, včetně urogenitálních tumorů, v důsledku úplného nevyvinutí lymfoidního systému embrya. Nové techniky byly studovány a následně generovány nové protokoly. Hlavní výzvou pro model xenoimplantátu v CAM je relativně vysoký výskyt embryonální smrti po odstranění vajíčka s úmrtností mezi 25 a 50 %.

Budou použita slepičí vejce, protože představují příznivé vaskularizační prostředí. Po růstu CAM, což je po 8 dnech oplození vajíčka, je přístup k krevním cévám vysoce usnadněn, což způsobuje, že s nimi lze manipulovat a pozorovat je. Díky tomu je schopen udržovat systémy a buňky způsobem, jakým lze provádět komplexní studie rakoviny.

Krevní cévy kromě vyživování vývoje -allo a xenograftů nově definovaly podpůrné prostředí jedinečné pro intravazaci a diseminaci nádorových buněk.

CAM je vysoce vaskularizovaná, což z ní dělá bohaté médium pro implantaci nádoru, kromě jiných faktorů, jako jsou proteiny. Tato podpora se nakonec týká výhradně invaze, diseminace a vaskularizace nádorových buněk.

Léčba genitourinárních nádorů není zatím individualizovaná, vzhledem k vysoké heterogenitě nádorů. Volba léčby, kterou pacient dostane, je definována populačními studiemi, které při převedení do kontextu individualizované léčby vykazují nedostatky.

Buněčná kultura a organoidy jsou jednoduchým modelem pro použití, který má nízkou cenu a rychlé výsledky. Když je však metoda aplikována na studium nádorů, výsledky nepředstavují podmínky prostředí nádoru, což nutí buňky k adaptaci, která interferuje s jejich růstem a reakcí na vzorce léčby. Modely xenograftů tak překonávají některá omezení kultury, takže rámec je pevný pro její vývoj. Naproti tomu vytváření protokolu o xenoimplantátech se stává složitějším, ale jedná se o reprezentativnější metodu rakoviny v jejím přirozeném prostředí. CAM byla studována se dvěma řetězci, in-ovo a ex-ovo. Pro in-ovo studie byl protokol vystaven naříznutím vaječných skořápek.

Ex-ovo studie se zaměřují na zlepšení dostupnosti CAM a embrya, umožňující jeho dokumentaci a manipulaci.

Nedávno byla popsána korelace mezi renálními tumory a lékovou rezistencí pomocí exogenního modelu CAM xenoimplantátu. To způsobuje, že jsou sledovány, studovány a zdokonalovány další aspekty, zejména pokud jde o angiogenezi a výzkum s nádory.

Hypotéza

Přibývá důkazů, že rozmanitost pacienta a rakoviny představuje hlavní výzvu v jejich léčbě, což ospravedlňuje hledání klinického nástroje schopného poskytnout informace o fenotypu odpovědi na léčbu pomocí platformy/avatar chorioalantoického nádoru (CTA).

Stejně jako již v klinické praxi zavedený antibiogram předjímá citlivost bakterií na antibiotika, existuje prostor pro individualizovanou léčbu s potenciálním přínosem pro výsledky rakoviny, kvalitu života a nákladovou efektivitu.

Definovat a předvídat nejlepší léčbu ("nádorový chemogram") pro každého pacienta s urogenitální rakovinou pomocí platformy fenotypu odpovědi na léčbu, protože avatar nádoru v chorioallantoické membráně může změnit klinickou praxi.

Cíle

• Ověřit účinnost výsevu čerstvé (okamžité) a zmrazené tkáně -80 stupňů (za 24 a 48h) jako strategii v případech selhání primárního výsevu;
• Vyhodnotit stabilitu neoplastické tkáně a zachování jejích charakteristik (genomických, proteomických, metabolických a fenotypových) na navržené platformě;
• Vyhodnotit fenotyp odpovědi na léčbu urogenitálních karcinomů u xenoimplantátu.
• Prozkoumat dopad implementace navrhované platformy na individualizovanou léčbu, její náklady a výsledky (onkologické i funkční) u pacientů s urogenitálními karcinomy.

Navrhovaná metodika

Prospektivní observační studie zahrnující 30 biopsií urogenitálních nádorů od pacientů příslušných nemocnic. Každá biopsie vytvoří až 12 nádorových explantátů o velikosti 1 až 2 mm2, které budou jednotlivě implantovány na chorioallantoickou membránu 1 kuřecího embrya k testování 10 navrhovaných léků plus 2 kontrolní vejce.

Na každou biopsii bude tedy potřeba 12 embryí. Biopsie urogenitálních primárních nádorů pacientů po souhlasu budou shromažďovány, které zajistí „Hospital das Clínicas da Unicamp“ a „Hospital Municipal de Paulínia“.

Materiál bude odebrán a umístěn do kultivačního média (McCoy) a uchováván na ledu do 24 hodin po resekci. Část tkáňových fragmentů bude rychle zmražena a uložena při -80oC pro další studie.

Bude vyhrazen bezpečnostní vzorek v ideálních podmínkách chlazení pro výsev záchrany v případě neúspěchu předchozího pokusu. Vzorky budou rozděleny tam, kde to bude možné:

• Čerstvý nádor: mitochondriální test, kultivace, western blot
• Formol nádoru: histopatologie, imunohistochemie
• Kultivace nádoru: chorioalantoická membrána, zmrazená Pro štěp biopsie nádoru se CAM použije, když jsou embrya stará 8 až 10 dnů.

Nejprve se pomocí kleští jemně protrhne vrstva CAM, poté se biopsie nádoru umístí do blízkosti rozvětvení cévy ve tvaru Y. Po umístění nádoru bude umístěno 200 ul PBS, aby se zabránilo kontaminaci. Po kontaktu štěpu s vaskularizací CAM bude v období 3 až 4 dnů sledován růst nádoru.

Tento proces bude vyhodnocen a pokud dojde k růstu nádoru, systém přejde do fáze léčby. Vzhledem k tomu, že došlo k růstu nádoru, bude léčba prováděna od 17 dnů po embryu. K léčbě budou použity dávky následujících léků: cisplatina, gemcitabin, paklitaxel, doxorubicin, karboplatina, pazopanib, sunitinib, sorafenib, methotrexát a vinblastin. Pro koncentraci léků budou umístěny vedle filtračního papíru v oblastech nádoru. Tato léčba bude trvat 3 až 4 dny, poté budou provedeny analýzy ke stanovení potenciálu každého léku.

Eutanazie embrya proběhne dekapitací (podle protokolu schváleného CEUA 4874-1 / 2018), protože má již vyvinutý systém bolesti.

Nůžky prořízly CAM kolem připojeného štěpu, přenesly se na Petriho misku s PBS. Přebytek CAM bude poté odstraněn a ponechá se pouze štěp k analýze histopatologií, imunohistochemií, western blotem a mitochondriálním hodnocením.

Rizika

Rizika spojená s účastí na této studii jsou minimální, protože nedochází k zásahům do ošetřování zkoumaného předmětu, pouze k použití malé části materiálu odebraného v ordinaci, který bude uložen k použití v laboratoři abyste se o nemoci dozvěděli ještě více, v případě potřeby konkrétně identifikujte budoucí léčbu s nejlepšími šancemi na výsledky.

Výhody

Tato studie umožní lepší znalost onemocnění s potenciálním přínosem při volbě budoucí léčby, aniž by se změnil jakýkoli aspekt současné léčby, kterou výzkumný subjekt dostává (nejlepší standardní léčba dostupná v té době).

Metodologie analýzy dat

Srovnání mezi skupinami primárních nádorů versus kultivovaných v xenoimplantátech bude provedeno pomocí jednocestné ANOVA s post hoc Bonferroniho testem. Data budou analyzována pomocí Studentových t-testů nebo opakovaných měření ANOVA (Bonferroniho post hoc test). Hladina významnosti bude definována jako menší než 0,05 pomocí Prism 5 (software GraphPad).

Primární výsledky

• Účinnost platformy (procentuální příjem nádoru)
• Reprezentativnost platformy (podobnost mezi čerstvým a kultivovaným nádorem)

Sekundární výsledky

• Definice fenotypu nádorové odpovědi na různé terapeutické možnosti.
• Vliv implementace navržené platformy na individualizovanou léčbu, její cenu a výsledky (onkologické i funkční)