Lehetséges terápiás válasz urogenitális daganatokban (Avatar)

Bevezetés

1. Fenotípusos értékelési modell

   1874-ben William Roberts és John Tyndall megfigyelte a sejtnövekedés gátlását az agarlemezen. Az 1940-es években Heatley javasolta az antimikrobiális oldatokat tartalmazó szűrőpapír korongok használatát, és bevezette a "radiális korong módszert".

   A WHO 1975-ben kiadott egy jelentést a módszertanról és a referenciamódszerről, amely alátámasztja a klinikai laboratóriumi szabványok nemzetközi szabványát. A mikroorganizmusok fenotípus-válasza az antibiotikum-kezelésre, a telepek proliferációjának összehasonlítása alapján, okot adhat az itt javasolt tumorkezelési válasz fenotípus platformhoz (beteg-eredetű tumor avatar).

2. A rák kezelése betegből származó xenograftokon (PDX)

   Egyénre szabott kezelés javasolásához ismerni kell a daganatkezelésre adott válasz fenotípusát, amely a gazdaszervezettől függően változik. A xenograftokat használó tanulmányokat bizonyos gyógyszerekre adott válasz előrejelzésére használják.

3. Korioallantois membrán

A chorioallantoic membrán (CAM) vizsgálatot gyors, reprodukálható módszerként használták a daganatellenes gyógyszerek in vivo tesztelésére. Ezt a vizsgálatot széles körben alkalmazták az angiogenezis tanulmányozására, és sikeresen fejlesztették ki xenograft tumormodellben is, beleértve az urogenitális daganatokat is, mivel az embrió limfoid rendszere teljesen nem fejlődött ki. Az új technikákat tanulmányozták, következésképpen új protokollokat hoztak létre. A xenograft modell fő kihívása a CAM-ban az embrionális halálozás viszonylag magas előfordulása a peteeltávolítást követően, 25 és 50% közötti mortalitási arány mellett.

A csirke tojásokat felhasználjuk, mert kedvező érrendszeri környezetet biztosítanak. A CAM növekedése után, ami 8 napos petesejt megtermékenyítés után következik be, nagymértékben megkönnyíti a vérerekhez való hozzáférést, aminek következtében azok manipulálhatók és megfigyelhetők. Ezáltal képes fenntartani a rendszereket és a sejteket olyan módon, ahogyan az összetett rákkal kapcsolatos vizsgálatok elvégezhetők.

A vérerek amellett, hogy táplálják az -allo és xenograftok fejlődését, ez újradefiniálta a támogató környezetet, amely egyedülálló a tumorsejtek intravazációjára és terjesztésére.

A CAM erősen vaszkularizált, ami gazdag táptalajt biztosít a tumorbeültetéshez, más tényezőkön, például fehérjéken kívül. Ez a támogatás végül kizárólag a tumorsejtek inváziójára, terjesztésére és vaszkularizációjára vonatkozik.

Az urogenitális daganatok kezelése a daganatok nagy heterogenitása miatt még nem egyedi. A páciens kezelésének megválasztását olyan populációs vizsgálatok határozzák meg, amelyek az egyéni kezelés kontextusába helyezve elégtelenségeket mutatnak.

A sejttenyészet és az organoidok egy egyszerűen alkalmazható modell, alacsony költséggel és gyors eredményekkel. Ha azonban a módszert daganatok vizsgálatára alkalmazzák, az eredmények nem tükrözik a tumor környezeti viszonyait, és a sejteket olyan alkalmazkodásra kényszerítik, amely megzavarja növekedésüket és a kezelési mintákra adott válaszát. Így a xenograft modellek legyőzik a kultúra bizonyos korlátait, így a keret szilárd a fejlődéséhez. Ezzel szemben a xenograft protokoll létrehozása bonyolultabbá válik, de ez egy reprezentatívabb módszer a rák természetes környezetében. A CAM-ot két szálon, in-ovo és ex-ovo segítségével vizsgálták. Az in-ovo vizsgálatokhoz a protokollt tojáshéj levágásával tették közzé.

Az ex-ovo tanulmányok a CAM és az embrió hozzáférhetőségének javítására összpontosítanak, lehetővé téve annak dokumentálását és manipulálását.

A közelmúltban összefüggést írtak le a vese daganatok és a gyógyszerrezisztencia között exogén CAM xenograft modell segítségével. Ez más szempontok nyomon követését, tanulmányozását és fejlesztését eredményezi, különösen az angiogenezis és a daganatokkal kapcsolatos kutatások tekintetében.

Hipotézis

Egyre több bizonyíték áll rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy a betegek és a rák sokfélesége jelenti a fő kihívást a kezelésük során, ami indokolja egy olyan klinikai eszköz keresését, amely a chorioallantoic tumor (CTA) platform/avatar segítségével képes információt szolgáltatni a kezelésre adott válasz fenotípusáról.

Ahogy a klinikai gyakorlatban már kialakult antibiogram előre jelzi a baktériumok antibiotikumokkal szembeni érzékenységét, van lehetőség egyénre szabott kezelésre, amely potenciális előnyökkel jár a rák kimenetelében, az életminőségben és a költséghatékonyságban.

A legjobb kezelés ("tumor kemográfia") meghatározása és előrejelzése minden urogenitális rákos beteg számára a kezelési válasz fenotípus platform segítségével, mivel a chorioallantois membránban lévő tumor avatar megváltoztathatja a klinikai gyakorlatot.

Célok

• Friss (azonnali) és fagyasztott szövet -80 fokos (24 és 48 óra alatt) vetésének hatékonyságának ellenőrzése stratégiaként az elsődleges vetés meghiúsulása esetén;
• A neoplasztikus szövet stabilitásának és jellemzőinek (genomikus, proteomikus, metabolikus és fenotípusos) fenntartásának értékelése a javasolt platformon;
• Az urogenitális karcinómák kezelésére adott válasz fenotípusának értékelése xenograftban.
• Feltárni a javasolt platform bevezetésének hatását az egyénre szabott kezelésre, annak költségeit és eredményeit (onkológiai és funkcionális) urogenitális karcinómás betegeknél.

Javasolt módszertan

Prospektív megfigyeléses vizsgálat, amely 30 urogenitális daganat biopsziáját tartalmazza az adott kórházak betegeitől. Minden biopszia legfeljebb 12, 1-2 mm2-es tumorexplantátumot generál, amelyeket egyenként 1 csirkeembrió chorioallantois membránjára ültetnek be a 10 javasolt gyógyszer és 2 kontrolltojás tesztelésére.

Ezért minden biopsziához 12 embrióra lesz szükség. A beleegyezés után a betegek urogenitális primer daganatairól biopsziát gyűjtenek, amelyet a "Hospital das Clínicas da Unicamp" és a "Hospital Municipal de Paulínia" biztosít.

Az anyagot összegyűjtik, táptalajba (McCoy) helyezik, és a reszekciót követő 24 órán belül jégen tartják. A szövetdarabok egy részét gyorsan lefagyasztják és -80 oC-on tárolják további vizsgálatok céljából.

Ideális hűtési körülmények között biztonsági mintát tartanak fenn az előző kísérlet meghiúsulása esetén történő mentéshez. A minták lehetőség szerint a következőkre oszlanak:

• Friss daganat: mitokondriális vizsgálat, tenyésztés, Western blot
• Tumor formol: hisztopatológia, immunhisztokémia
• Tumortenyészet: chorioallantois membrán, fagyasztva A tumorbiopsziás grafthoz a CAM-ot akkor használják, ha az embriók 8-10 naposak.

Először a CAM-réteget finoman felszakítják egy csipesszel, majd a daganat biopsziáját egy véredény Y-alakú bifurkációjához közel helyezik el. A daganat felhelyezése után 200 ul PBS-t helyezünk a fertőzés megelőzésére. Miután a graft érintkezésbe kerül a CAM vaszkularizációjával, a daganat növekedését 3-4 napon belül monitorozni fogják.

Ezt a folyamatot értékelik, és ha daganatnövekedés van, a rendszer a kezelési fázisba lép. Mivel tumornövekedés volt, a kezeléseket az embrió megjelenése után 17 nappal kezdik meg. Az alkalmazott kezelések a következő gyógyszerek adagjai lesznek: ciszplatin, gemcitabin, paklitaxel, doxorubicin, karboplatin, pazopanib, szunitinib, szorafenib, metotrexát és vinblasztin. A gyógyszerek koncentrálására a daganatos régiókban a szűrőpapír mellé kerülnek. Ez a kezelés 3-4 napot vesz igénybe, majd elemzéseket végeznek az egyes gyógyszerek potenciáljának meghatározására.

Az embrió eutanáziája lefejezéssel történik (a CEUA 4874-1 / 2018 számú jegyzőkönyv szerint), mivel már rendelkezik fejlett fájdalomrendszerrel.

Ollóval átvágtuk a CAM-ot a csatolt graft körül, és átvittük egy Petri-csészébe PBS-sel. A feleslegben lévő CAM eltávolításra kerül, és csak a graft marad a kórszövettani, immunhisztokémiai, Western-blot és mitokondriális értékelés alapján.

Kockázatok

A jelen tanulmányban való részvétel kockázata minimális, mivel a kutatás tárgyának kezelésébe nem avatkoznak bele, csak a műtéten kivont anyag egy kis részét használják fel, amelyet laboratóriumi felhasználásra iktatnak be. annak érdekében, hogy még többet megtudjon a betegségről, szükség esetén konkrétan határozza meg azokat a jövőbeli kezeléseket, amelyeknek a legjobb esélye van az eredményre.

Előnyök

Ez a tanulmány lehetővé teszi a betegség jobb megismerését, ami potenciális előnyökkel jár a jövőbeni kezelések megválasztásában, anélkül, hogy megváltoztatná a kutatási alany jelenlegi kezelésének bármely aspektusát (az akkoriban elérhető legjobb standard kezelés).

Adatelemzési módszertan

Az elsődleges tumorcsoportok és a xenograftban tenyésztett csoportok összehasonlítása egyutas ANOVA-val történik, a post hoc Bonferroni teszttel. Az adatokat Student t-próbákkal vagy ANOVA ismételt mérésekkel (Bonferroni post hoc teszt) elemzik. A szignifikancia szintje 0,05-nél kisebb a Prism 5 (GraphPad szoftver) használatával.

Elsődleges eredmények

• A platform hatékonysága (a daganat aránya százalékban)
• Platform reprezentativitás (hasonlóság a friss és a termesztett daganat között)

Másodlagos eredmények

• A tumorválasz fenotípusának meghatározása különböző terápiás lehetőségekre.
• A javasolt platform bevezetésének hatása az egyénre szabott kezelésre, költsége és eredményei (onkológiai és funkcionális)