비뇨생식기 종양의 잠재적 치료 반응 (Avatar)

소개

1. 표현형 평가 모델

   1874년 William Roberts와 John Tyndall은 한천 플레이트에서 세포 성장이 억제되는 것을 관찰했습니다. 1940년대에 Heatley는 항균 용액이 포함된 여과지 디스크의 사용을 제안하고 "방사형 디스크 방법"을 도입했습니다.

   WHO는 1975년 임상 검사 표준의 국제 표준을 지원하는 방법론 및 참조 방법에 대한 보고서를 발표했습니다. 콜로니의 증식을 비교하는 항생제 치료에 대한 미생물의 표현형 반응은 여기에서 제안된 종양 치료 반응 표현형 플랫폼(환자 유래 종양 아바타)에 대한 이론적 근거를 제공할 수 있습니다.

2. 환자 유래 이종이식(PDX)에 대한 암 치료

   개별화된 치료를 제안하기 위해서는 숙주에 따라 달라지는 종양 치료 반응 표현형을 알아야 합니다. 이종 이식편을 사용한 연구는 특정 약물에 대한 반응을 예측하는 데 사용되고 있습니다.

3. 융모막요막

chorioallantoic 막 (CAM) 분석은 생체 내 항종양 약물 테스트를 위한 빠르고 재현 가능한 방법으로 사용되었습니다. 이 분석은 혈관신생 연구에 널리 사용되어 왔으며 배아의 림프계가 완전히 발달하지 않았기 때문에 비뇨생식기 종양을 포함한 이종이식 종양 모델에서도 성공적으로 개발되었습니다. 새로운 기술이 연구되어 결과적으로 새로운 프로토콜이 생성되었습니다. CAM의 이종이식 모델에 대한 주요 과제는 난자 제거 후 사망률이 25~50%로 비교적 높은 배아 사망 발생입니다.

병아리 알은 유리한 혈관 형성 환경을 제공하기 때문에 사용됩니다. 난자 수정 8일 후인 CAM의 성장 후 혈관에 대한 접근이 매우 쉬워져 조작되고 관찰됩니다. 이를 통해 복잡한 암 연구를 수행할 수 있는 방식으로 시스템과 세포를 유지할 수 있습니다.

혈관은 알로 및 이종이식의 발달에 영양을 공급하는 것 외에도 종양 세포의 침범 및 전파에 고유한 지원 환경을 재정의했습니다.

CAM은 혈관이 풍부하여 단백질과 같은 다른 요인 외에도 종양 이식을 위한 풍부한 배지가 됩니다. 이 지원은 결국 종양 세포의 침입, 전파 및 혈관 형성에만 배타적입니다.

비뇨생식기 종양의 치료는 종양의 높은 이질성으로 인해 아직 개별화되지 않았습니다. 환자가 받게 될 치료의 선택은 개별화된 치료의 맥락으로 전환될 때 부적절함을 나타내는 인구 연구에 의해 정의됩니다.

세포 배양 및 오가노이드는 적용할 간단한 모델로 비용이 저렴하고 결과가 빠릅니다. 그러나이 방법을 종양 연구에 적용하면 결과가 종양 환경 조건을 나타내지 않아 세포가 성장과 치료 패턴에 대한 반응을 방해하는 적응을 강요합니다. 따라서 이종이식 모델은 문화의 일부 제한을 극복하여 개발을 위한 프레임워크가 견고합니다. 대조적으로, 이종이식 프로토콜의 생성은 더 복잡해지지만, 자연 환경에서 암의 더 대표적인 방법입니다. CAM은 in-ovo 및 ex-ovo의 두 가닥으로 연구되었습니다. in-ovo 연구의 경우 달걀 껍질을 절단하여 프로토콜을 노출했습니다.

ex-ovo 연구는 CAM 및 배아의 접근성을 개선하여 문서화 및 조작을 가능하게 하는 데 중점을 둡니다.

최근 외인성 CAM 이종이식 모델을 사용하여 신장 종양과 약물 내성 사이의 상관관계가 설명되었습니다. 이로 인해 특히 혈관 신생 및 종양 연구와 관련하여 다른 측면을 모니터링, 연구 및 개선할 수 있습니다.

가설

환자와 암의 다양성이 치료의 주요 과제라는 증거가 증가하고 있으며, 이는 맥락요막종양(CTA) 플랫폼/아바타를 사용하여 치료에 대한 반응의 표현형에 대한 정보를 제공할 수 있는 임상 도구를 찾는 것을 정당화합니다.

임상 실습에서 이미 확립된 항생제가 항생제에 대한 박테리아의 감수성을 예상하는 것처럼 암 결과, 삶의 질 및 비용 효율성에 잠재적인 이점이 있는 개별화된 치료의 여지가 있습니다.

chorioallantoic 막의 종양 아바타가 임상 실습을 변화시킬 수 있기 때문에 치료 반응 표현형 플랫폼을 사용하여 비뇨 생식기 암이 있는 각 환자에 대한 최상의 치료("종양 케모그램")를 정의하고 예상합니다.

목표

• 1차 파종이 실패한 경우의 전략으로 신선(즉시) 및 냉동 조직 -80도(24시간 및 48시간) 파종의 효율성을 확인하기 위해;
• 제안된 플랫폼에서 종양 조직의 안정성과 그 특성(유전체, 단백질, 대사 및 표현형)의 유지를 평가하기 위해;
• 이종이식에서 비뇨생식기 암종의 치료에 대한 반응 표현형을 평가하기 위함.
• 제안된 플랫폼 구현이 개별화된 치료에 미치는 영향, 비뇨생식기 암종 환자의 비용 및 결과(종양학적 및 기능적)를 탐색합니다.

제안된 방법론

각 병원 환자의 비뇨 생식기 종양 생검 30건을 포함한 전향적 관찰 연구. 각 생검은 1~2mm2의 최대 12개의 종양 외식편을 생성할 것이며, 이는 10개의 제안된 약물과 2개의 대조군 계란을 테스트하기 위해 닭 배아 1개의 융모요막에 개별적으로 이식될 것입니다.

따라서 각 생검에 12개의 배아가 필요합니다. "Hospital das Clínicas da Unicamp" 및 "Hospital Municipal de Paulínia"에서 동의 후 환자의 비뇨생식기 원발 종양 생검을 수집합니다.

재료를 수집하여 배양 배지(McCoy)에 넣고 절제 후 24시간 이내에 얼음에 보관합니다. 조직 조각의 일부는 추가 연구를 위해 급속 냉동되어 -80oC에서 보관됩니다.

이전 시도가 실패한 경우 구조 파종을 위해 이상적인 냉장 조건에서 안전 샘플로 예약됩니다. 샘플은 가능한 경우 다음과 같이 나뉩니다.

• 신선한 종양: 미토콘드리아 분석, 배양, 웨스턴 블롯
• 종양 형태: 조직병리학, 면역조직화학
• 종양 배양: 융모요요막, 냉동 종양 생검 이식의 경우 배아가 8~10일일 때 CAM을 사용합니다.

먼저 겸자를 사용하여 CAM 층을 부드럽게 파열시킨 다음 종양 생검을 혈관의 Y자형 분기점 근처에 배치합니다. 종양을 배치한 후 오염을 방지하기 위해 200ul의 PBS를 배치합니다. 이식편이 CAM의 혈관화와 접촉한 후, 종양 성장은 3~4일의 기간에 모니터링됩니다.

이 과정을 평가하고 종양 성장이 있는 경우 시스템은 치료 단계로 이동합니다. 종양 성장이 있었기 때문에 치료는 배아 후 17일부터 시행됩니다. 사용되는 치료법은 시스플라틴, 젬시타빈, 파클리탁셀, 독소루비신, 카보플라틴, 파조파닙, 수니티닙, 소라페닙, 메토트렉세이트 및 빈블라스틴과 같은 약물의 용량입니다. 약물의 농축을 위해 종양 부위의 여과지 옆에 배치됩니다. 이 치료는 3~4일이 소요되며, 그 후 각 약물의 가능성을 결정하기 위한 분석이 수행됩니다.

배아의 안락사는 이미 발달된 통증 시스템을 가지고 있기 때문에 (CEUA 4874-1 / 2018 승인 프로토콜에 따라) 참수에 의해 발생합니다.

부착된 이식편 주변의 CAM을 가위로 자르고 PBS가 있는 페트리 접시로 옮겼습니다. CAM의 초과분은 조직병리학, 면역조직화학, 웨스턴 블롯팅 및 미토콘드리아 평가로 분석할 이식편만 남기고 제거됩니다.

위험

연구 대상자의 치료에 간섭이 없고 실험실에서 사용하기 위해 제출될 수술에서 인출된 재료의 작은 부분만 사용하기 때문에 이 연구 참여와 관련된 위험은 최소화됩니다. 질병에 대해 더 많이 알기 위해 필요한 경우 결과를 얻을 가능성이 가장 높은 향후 치료법을 구체적으로 확인하십시오.

이익

이 연구는 연구 대상이 받고 있는 현재 치료(당시 이용 가능한 최상의 표준 치료)의 어떤 측면도 변경하지 않고 향후 치료 선택에 잠재적인 이점과 함께 질병에 대한 더 많은 지식을 제공할 것입니다.

데이터 분석 방법론

1차 종양 그룹 대 이종이식편에서 배양된 그룹 사이의 비교는 Bonferroni 사후 테스트와 함께 일원 ANOVA를 사용하여 수행될 것입니다. 데이터는 Student t-test 또는 ANOVA 반복 측정(Bonferroni post hoc test)을 사용하여 분석됩니다. 유의 수준은 Prism 5(GraphPad 소프트웨어)를 사용하여 0.05 미만으로 정의됩니다.

주요 결과

• 플랫폼 효율성(종양 비율)
• 플랫폼 대표성(신생종양과 배양종양의 유사성)

이차 결과

• 다양한 치료 옵션에 대한 종양 반응 표현형의 정의.
• 제안된 플랫폼 구현이 개별화된 치료, 비용 및 결과(종양학적 및 기능적)에 미치는 영향