Potencjalna odpowiedź terapeutyczna w guzach układu moczowo-płciowego (Avatar)

Wstęp

1. Model oceny fenotypowej

   W 1874 roku William Roberts i John Tyndall zaobserwowali zahamowanie wzrostu komórek na płytce agarowej. W latach czterdziestych Heatley zasugerował użycie krążków z bibuły filtracyjnej zawierających roztwory przeciwdrobnoustrojowe i wprowadził „metodę krążków promieniowych”.

   WHO opublikowała raport na temat metodologii i metody referencyjnej w 1975 roku, które wspierają międzynarodowy standard Klinicznych Standardów Laboratoryjnych. Odpowiedź fenotypowa mikroorganizmów na leczenie antybiotykami, porównując proliferację kolonii, może stanowić uzasadnienie dla proponowanej tutaj platformy fenotypowej odpowiedzi na leczenie nowotworu (awatar nowotworu pochodzący od pacjenta).

2. Leczenie raka na ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjenta (PDX)

   Aby zaproponować zindywidualizowane leczenie, konieczna jest znajomość fenotypu odpowiedzi na leczenie nowotworu, który różni się w zależności od gospodarza. Badania z wykorzystaniem ksenoprzeszczepów są wykorzystywane do przewidywania odpowiedzi na niektóre leki.

3. Błona kosmówkowo-omoczniowa

Test z błoną kosmówkowo-omoczniową (CAM) był stosowany jako szybka, powtarzalna metoda testowania leków przeciwnowotworowych in vivo. Test ten był szeroko stosowany do badania angiogenezy i został również z powodzeniem opracowany w modelu heteroprzeszczepu guza, w tym guzów układu moczowo-płciowego, ze względu na całkowity brak rozwoju układu limfatycznego zarodka. Zbadano nowe techniki, tworząc w konsekwencji nowe protokoły. Głównym wyzwaniem dla modelu ksenoprzeszczepu w CAM jest stosunkowo wysoka częstość występowania obumierania embrionów po usunięciu komórki jajowej, ze śmiertelnością między 25 a 50%.

Wykorzystane zostaną jaja kurze, ponieważ stanowią one sprzyjające środowisko unaczynienia. Po wzroście CAM, czyli po 8 dniach od zapłodnienia komórki jajowej, dostęp do naczyń krwionośnych jest znacznie ułatwiony, co powoduje, że można nimi manipulować i obserwować. Dzięki temu jest w stanie utrzymać układy i komórki w sposób umożliwiający prowadzenie złożonych badań nad rakiem.

Naczynia krwionośne, oprócz odżywiania rozwoju allo i ksenoprzeszczepów, na nowo zdefiniowały sprzyjające środowisko, unikalne dla inwazji i rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych.

CAM jest silnie unaczyniony, co czyni go bogatym podłożem do implantacji guza, oprócz innych czynników, takich jak białka. Wsparcie to ogranicza się wyłącznie do inwazji, rozprzestrzeniania się i unaczynienia komórek nowotworowych.

Leczenie guzów układu moczowo-płciowego nie jest jeszcze zindywidualizowane ze względu na dużą niejednorodność guzów. Wybór leczenia, które otrzyma pacjent, jest określony przez badania populacyjne, które przedstawiają nieprawidłowości po przeniesieniu do kontekstu zindywidualizowanego leczenia.

Hodowla komórkowa i organoidy to prosty model do zastosowania, charakteryzujący się niskim kosztem i szybkimi wynikami. Jednak gdy metoda jest stosowana do badania nowotworów, wyniki nie odzwierciedlają warunków środowiska guza, zmuszając komórki do adaptacji, która zakłóca ich wzrost i reakcję na wzorce leczenia. W ten sposób modele ksenoprzeszczepów pokonują pewne ograniczenia kultury, dzięki czemu ramy są solidne dla jej rozwoju. W przeciwieństwie do tego, tworzenie protokołu ksenoprzeszczepów staje się bardziej złożone, ale jest to bardziej reprezentatywna metoda raka w jego naturalnym środowisku. CAM badano za pomocą dwóch nici, in-ovo i ex-ovo. W przypadku badań in-ovo protokół eksponowano przez cięcie skorupki jaja.

Badania ex-ovo koncentrują się na poprawie dostępności CAM i zarodka, umożliwiając jego dokumentację i manipulację.

Ostatnio opisano korelację między guzami nerek a lekoopornością przy użyciu egzogennego modelu ksenoprzeszczepu CAM. Powoduje to, że inne aspekty są monitorowane, badane i ulepszane, zwłaszcza w odniesieniu do angiogenezy i badań nad nowotworami.

Hipoteza

Istnieje coraz więcej dowodów na to, że różnorodność pacjentów i nowotworów stanowi główne wyzwanie w ich leczeniu, co uzasadnia poszukiwanie narzędzia klinicznego zdolnego do dostarczania informacji na temat fenotypu odpowiedzi na leczenie przy użyciu platformy/awatara guza kosmówkowo-omoczniowego (CTA).

Tak jak antybiogram ustalony już w praktyce klinicznej przewiduje wrażliwość bakterii na antybiotyki, tak jest miejsce na zindywidualizowane leczenie z potencjalną korzyścią w zakresie wyników leczenia raka, jakości życia i opłacalności.

Zdefiniowanie i przewidywanie najlepszego leczenia („chemogram guza”) dla każdego pacjenta z rakiem układu moczowo-płciowego przy użyciu platformy fenotypów odpowiedzi na leczenie, ponieważ awatar guza w błonie kosmówkowo-omoczniowej może zmienić praktykę kliniczną.

Cele

• Sprawdzenie skuteczności wysiewu tkanki świeżej (doraźnej) i mrożonej -80 stopni (w 24 i 48h) jako strategii w przypadku niepowodzenia siewu pierwotnego;
• Ocena stabilności tkanki nowotworowej i zachowania jej cech (genomowych, proteomicznych, metabolicznych i fenotypowych) w proponowanej platformie;
• Ocena fenotypu odpowiedzi na leczenie raka układu moczowo-płciowego w heteroprzeszczepie.
• Zbadanie wpływu wdrożenia proponowanej platformy na zindywidualizowane leczenie, jego koszt i wyniki (onkologiczne i czynnościowe) u pacjentów z rakiem układu moczowo-płciowego.

Proponowana metodologia

Prospektywne badanie obserwacyjne obejmujące 30 biopsji guzów układu moczowo-płciowego od pacjentów z odpowiednich szpitali. Każda biopsja wygeneruje do 12 eksplantów guza o powierzchni od 1 do 2 mm2, które zostaną wszczepione pojedynczo na błonę kosmówkowo-omoczniową 1 zarodka kurzego w celu przetestowania 10 proponowanych leków oraz 2 jaj kontrolnych.

Dlatego do każdej biopsji potrzebnych będzie 12 zarodków. Biopsje guzów pierwotnych układu moczowo-płciowego pacjentów po wyrażeniu zgody będą pobierane przez „Hospital das Clínicas da Unicamp” i „Hospital Municipal de Paulínia”.

Materiał zostanie zebrany i umieszczony w pożywce hodowlanej (McCoy) i przechowywany w lodzie w ciągu 24 godzin po resekcji. Część fragmentów tkanek zostanie szybko zamrożona i przechowywana w temperaturze -80oC do dalszych badań.

Zostanie zachowana próbka bezpieczeństwa w idealnych warunkach chłodniczych do siewu ratunkowego w przypadku niepowodzenia poprzedniej próby. W miarę możliwości próbki zostaną podzielone na:

• Świeży guz: test mitochondrialny, hodowla, western blot
• Formol guza: histopatologia, immunohistochemia
• Hodowla guza: błona kosmówkowo-omoczniowa, zamrożona W przypadku przeszczepu z biopsji guza CAM zostanie użyty, gdy zarodki będą miały od 8 do 10 dni.

Najpierw warstwa CAM zostanie delikatnie rozerwana za pomocą kleszczy, następnie biopsja guza zostanie umieszczona w pobliżu rozwidlenia naczynia krwionośnego w kształcie litery Y. Po umieszczeniu guza zostanie umieszczone 200 ul PBS, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Po zetknięciu się przeszczepu z unaczynieniem CAM, wzrost guza będzie monitorowany przez okres 3 do 4 dni.

Proces ten zostanie oceniony iw przypadku wzrostu guza system przejdzie do fazy leczenia. Ponieważ nastąpił rozrost guza, zabiegi będą wykonywane od 17 dnia po zarodku. Zastosowane leczenie będzie polegało na podawaniu dawek następujących leków: cisplatyna, gemcytabina, paklitaksel, doksorubicyna, karboplatyna, pazopanib, sunitynib, sorafenib, metotreksat i winblastyna. W celu stężenia leków zostaną one umieszczone obok bibuły filtracyjnej w obszarach guza. Leczenie to potrwa od 3 do 4 dni, po których zostaną przeprowadzone analizy w celu określenia potencjału każdego leku.

Eutanazja zarodka nastąpi przez dekapitację (zgodnie z protokołem zatwierdzonym CEUA 4874-1/2018), ponieważ ma on już rozwinięty system bólu.

Przeciąć nożyczkami CAM wokół przyczepionego przeszczepu, przenieść na szalkę Petriego z PBS. Nadmiar CAM zostanie następnie usunięty, pozostawiając jedynie przeszczep do analizy histopatologicznej, immunohistochemicznej, western blotting i oceny mitochondrialnej.

Ryzyka

Ryzyko związane z udziałem w tym badaniu jest minimalne, ponieważ nie ma ingerencji w leczenie przedmiotu badań, a jedynie wykorzystanie niewielkiej części materiału pobranego w zabiegu, który zostanie złożony do wykorzystania w laboratorium aby dowiedzieć się jeszcze więcej o chorobie, w razie potrzeby konkretnie określić przyszłe metody leczenia z największymi szansami na wyniki.

Korzyści

Badanie to pozwoli na pogłębienie wiedzy na temat choroby z potencjalną korzyścią w wyborze przyszłych metod leczenia, bez zmiany jakiegokolwiek aspektu obecnego leczenia, które otrzymuje badany (najlepsze standardowe leczenie dostępne w tym czasie).

Metodologia analizy danych

Porównania między pierwotnymi grupami guzów i hodowanymi w ksenoprzeszczepach zostaną przeprowadzone przy użyciu jednoczynnikowej analizy ANOVA z testem post hoc Bonferroniego. Dane będą analizowane przy użyciu testów t-Studenta lub powtarzanych pomiarów ANOVA (test post hoc Bonferroniego). Poziom istotności zostanie zdefiniowany jako mniejszy niż 0,05 przy użyciu Prism 5 (oprogramowanie GraphPad).

Podstawowe wyniki

• Wydajność platformy (ujęcie guza w procentach)
• Reprezentatywność platformy (podobieństwo między nowotworem świeżym a wyhodowanym)

Wyniki drugorzędne

• Definicja fenotypu odpowiedzi guza na różne opcje terapeutyczne.
• Wpływ proponowanej implementacji platformy na zindywidualizowane leczenie, jego koszt oraz wyniki (onkologiczne i funkcjonalne)