Potensiell terapeutisk respons i urogenitale svulster (Avatar)

Introduksjon

1. Fenotypisk evalueringsmodell

   I 1874 observerte William Roberts og John Tyndall hemming av cellevekst på agarplaten. På 1940-tallet foreslo Heatley bruk av filterpapirskiver som inneholder antimikrobielle løsninger og introduserte "radialskivemetoden".

   WHO ga ut en rapport om metodikken og referansemetoden i 1975, som støtter den internasjonale standarden for kliniske laboratoriestandarder. Fenotyperesponsen til mikroorganismer på antibiotikabehandling, som sammenligner spredningen av kolonier, kan gi en begrunnelse for den her foreslåtte fenotypeplattformen for tumorbehandlingsrespons (pasientavledet tumoravatar).

2. Kreftbehandling på pasientavledede xenografter (PDX)

   For å foreslå en individualisert behandling er det nødvendig å kjenne til svulstbehandlingsresponsfenotypen, som varierer med verten. Studier som bruker xenografts blir brukt til å forutsi en respons på visse medikamenter.

3. Korioallantoisk membran

Chorioallantoic membran (CAM)-analysen har blitt brukt som en rask, reproduserbar metode for antitumormedisintesting in vivo. Denne analysen har blitt mye brukt for studiet av angiogenese og har også blitt utviklet med suksess i en xenograft-tumormodell, inkludert urogenitale svulster, på grunn av den totale ikke-utviklingen av lymfoidsystemet til embryoet. De nye teknikkene har blitt studert, og genererer følgelig nye protokoller. Den største utfordringen for xenograft-modellen i CAM er en relativt høy forekomst av embryonal død etter eggfjerning, med en dødelighet mellom 25 og 50 %.

Kyllingeggene vil bli brukt fordi de gir et gunstig vaskulariseringsmiljø. Etter veksten av CAM, som er etter 8 dager med eggbefruktning, er tilgangen til blodårene svært lettet, noe som fører til at de blir manipulert og observert. Dette gjør det i stand til å opprettholde systemer og celler på den måten som komplekse kreftstudier kan gjøres.

Blodkar i tillegg til å nære utviklingen av -allo og xenografts, redefinerte dette et støttende miljø som er unikt for intravasasjon og spredning av tumorceller.

CAM er svært vaskularisert, noe som gjør det til et rikt medium for tumorimplantasjon, i tillegg til andre faktorer som proteiner. Denne støtten ender opp med å være eksklusiv for invasjon, spredning og vaskularisering av tumorceller.

Behandling av genitourinære svulster er ennå ikke individualisert, på grunn av svulstenes høye heterogenitet. Valget av behandling som pasienten vil få, er definert av befolkningsstudier som viser utilstrekkelighet når de overføres til konteksten for den individualiserte behandlingen.

Cellekulturen og organoidene er en enkel modell som skal brukes, med lave kostnader og raske resultater. Men når metoden brukes på studiet av svulster, representerer ikke resultatene tumormiljøforhold, noe som tvinger cellene til en tilpasning som forstyrrer deres vekst og respons på behandlingsmønstre. Dermed overvinner xenograft-modellene noen begrensninger i kulturen slik at rammeverket er solid for utviklingen. I motsetning til dette blir opprettelsen av en xenograft-protokoll mer kompleks, men det er en mer representativ metode for kreft i sitt naturlige miljø. CAM ble studert med to tråder, in-ovo og ex-ovo. For in-ovo-studier ble protokollen eksponert ved å kutte eggeskall.

Ex-ovo-studiene fokuserer på å forbedre tilgjengeligheten til CAM og embryoet, noe som muliggjør dokumentasjon og manipulering av det.

Nylig har det blitt beskrevet en korrelasjon mellom nyretumorer og medikamentresistens ved bruk av eksogen CAM xenograft-modell. Dette fører til at andre aspekter overvåkes, studeres og forbedres, spesielt når det gjelder angiogenese og forskning med svulster.

Hypotese

Det er økende bevis for at mangfoldet av pasienten og kreften representerer hovedutfordringen i deres behandling, noe som rettferdiggjør søket etter et klinisk verktøy som er i stand til å gi informasjon om fenotypen av respons på behandling ved bruk av chorioallantoic tumor (CTA) plattformen/avataren.

Akkurat som antibiogrammet som allerede er etablert i klinisk praksis forutser bakteriers mottakelighet for antibiotika, er det rom for individualisert behandling med potensiell nytte for kreftutfall, livskvalitet og kostnadseffektivitet.

Å definere og forutse den beste behandlingen ("tumorkjemogram") for hver pasient med urogenital kreft ved å bruke fenotypeplattform for behandlingsrespons, da tumoravataren i den korioallantoiske membranen kan transformere den kliniske praksisen.

Mål

• For å verifisere effektiviteten av såingen av ferskt (umiddelbart) og frossent vev -80 grader (i 24 og 48 timer) som en strategi i tilfeller av svikt i primær såing;
• For å evaluere stabiliteten til det neoplastiske vevet og opprettholdelsen av dets egenskaper (genomisk, proteomisk, metabolsk og fenotypisk) i den foreslåtte plattformen;
• For å evaluere responsfenotypen på behandlingen av urogenitale karsinomer i xenograft.
• Å utforske virkningen av den foreslåtte plattformimplementeringen på individualisert behandling, dens kostnader og resultater (onkologisk og funksjonell) hos pasienter med urogenitale karsinomer.

Foreslått metodikk

En prospektiv observasjonsstudie inkludert 30 biopsier av urogenitale svulster fra pasienter ved de respektive sykehusene. Hver biopsi vil generere opptil 12 tumoreksplantater på 1 til 2 mm2, som vil bli implantert individuelt på chorioallantoic-membranen til 1 kyllingembryo for å teste de 10 foreslåtte medikamentene, pluss 2 kontrollegg.

Derfor vil det være nødvendig med 12 embryoer for hver biopsi. Biopsier av urogenitale primære svulster fra pasienter etter samtykke vil bli samlet inn, levert av "Hospital das Clínicas da Unicamp" og "Hospital Municipal de Paulínia".

Materialet vil bli samlet og plassert i kulturmedium (McCoy) og holdt på is innen 24 timer etter reseksjon. En del av vevsfragmentene vil bli raskt frosset og lagret ved -80oC for videre studier.

Det vil bli reservert en sikkerhetsprøve under ideelle kjøleforhold for såing av redning i tilfeller av feil på forrige forsøk. Prøver deles der det er mulig i:

• Frisk svulst: mitokondriell analyse, kultur, western blot
• Tumorformol: histopatologi, immunhistokjemi
• Tumorkultur: korioallantoisk membran, frossen For tumorbiopsigraft vil CAM brukes når embryoene er 8 til 10 dager gamle.

Først vil CAM-laget bli forsiktig rupturert ved hjelp av en tang, deretter vil biopsien av svulsten plasseres nær en Y-formet bifurkasjon av et blodkar. Etter plassering av svulsten, vil 200 ul PBS plasseres for å forhindre kontaminering. Etter at transplantatet kommer i kontakt med vaskulariseringen av CAM, vil tumorveksten overvåkes i en periode på 3 til 4 dager.

Denne prosessen vil bli evaluert og hvis det er tumorvekst vil systemet gå til behandlingsfasen. Siden det var tumorvekst, vil behandlingene utføres fra 17 dager etter embryoet. Behandlingene som brukes vil være doser av følgende medisiner: cisplatin, gemcitabin, paklitaksel, doksorubicin, karboplatin, pazopanib, sunitinib, sorafenib, metotreksat og vinblastin. For konsentrasjonen av medikamentene vil de bli plassert ved siden av filterpapiret i tumorregionene. Denne behandlingen vil ta fra 3 til 4 dager, hvoretter analyser vil bli utført for å bestemme potensialet til hvert medikament.

Eutanasi av embryoet vil skje ved halshugging (i henhold til protokollen godkjent CEUA 4874-1 / 2018) siden det allerede har et utviklet smertesystem.

Saks kuttet gjennom CAM rundt det vedlagte transplantatet, overført til en petriskål med PBS. Overskuddet av CAM vil deretter bli fjernet, slik at bare transplantatet skal analyseres ved histopatologi, immunhistokjemi, western blotting og mitokondrie-evaluering.

Risikoer

Risikoen forbundet med å delta i denne studien er minimal, da det ikke er noen innblanding i behandlingen av emnet for forskningen, kun bruken av en liten del av materialet som er trukket tilbake i operasjonen som vil bli arkivert for bruk i laboratoriet for å vite enda mer om sykdommen, spesifikt identifisere fremtidige behandlinger med de beste sjansene for resultater om nødvendig.

fordeler

Denne studien vil gi større kunnskap om sykdommen med en potensiell fordel ved valg av fremtidige behandlinger, uten å endre noen aspekter av den nåværende behandlingen som forskningsobjektet mottar (den beste standardbehandlingen tilgjengelig på det tidspunktet).

Dataanalysemetodikk

Sammenligninger mellom primære tumorgrupper versus dyrket i xenograft vil bli utført ved bruk av enveis ANOVA med post hoc Bonferroni-testen. Data vil bli analysert ved hjelp av Student t-tester eller ANOVA gjentatte mål (Bonferroni post hoc test). Signifikansnivået vil bli definert som mindre enn 0,05 ved bruk av Prism 5 (GraphPad-programvare).

Primære utfall

• Plattformeffektivitet (prosent av svulstopptak)
• Plattformrepresentativitet (likhet mellom fersk og dyrket svulst)

Sekundære utfall

• Definisjon av tumorresponsfenotype til forskjellige terapeutiske alternativer.
• Virkningen av den foreslåtte plattformimplementeringen på individualisert behandling, dens kostnader og resultater (onkologisk og funksjonell)