腸チフス患者およびワクチン接種者における細胞性免疫応答

研究プロジェクトの説明: IFN-γ と IL-17 が腸チフス患者で増加することが以前に示されています。 腸チフス菌感染は、多くの主要な腸チフス抗原（LPS）HlyE、べん毛タンパク質FliCおよびシャペロンタンパク質EcpDに対する抗体応答を誘導することが示された。 腸性下痢性疾患コレラでは、MAIT 細胞が活性化され、関連する LPS 特異的抗体応答が生成されます。 ヒト チャレンジ モデル研究では、CD8+ T 細胞記憶細胞が腸チフスに対する防御の重要な相関関係にあることが示されています。 弱毒生腸チフスワクチン（TY21a）も、免疫後にMAIT細胞を誘導します。 IL-12、IL-15、IL-18 はマウスモデルでメモリー様 NK 細胞を誘導し、IL-21 は結核菌感染を防御するメモリー様 NK 細胞を誘導することが示されています。 活性化された MAIT 細胞、およびサイトカインが腸チフスにおけるメモリー様 NK 細胞を誘導する役割は現在不明です。

好中球によって採用される複数の殺害メカニズムの 1 つは、ミエロペルオキシダーゼ (MPO)、エラスターゼ、リゾチーム、およびデフェンシンを含む好中球細胞外トラップ (NET) の放出です。 感染は、微生物病原体をトラップする NET のリリースを誘発します。 腸チフス患者から分離された好中球は NET を放出し、その好中球 NET 放出は、サブユニット結合ワクチンによるワクチン接種によってプライミングされます。

研究介入: Typbar-TCV は腸チフス Vi 莢膜多糖類破傷風トキソイド結合ワクチンです。 Typbar-TCV は、臨床的に証明された世界初の複合腸チフスワクチンです。 このワクチンは WHO の事前認定を受けており、2 歳未満の子供と乳児に対して承認されています。 第 III 相臨床試験中、Typbar-TCV の単回投与は、生後 6 か月以上から 2 年まで、2 歳以上から 15 歳まで、および 15 歳以上から 45 歳までの被験者において、98.05%、99.17%、および 92.13% の 4 倍のセロコンバージョン率を誘発しました。年。 研究のワクチン接種群の各志願者は、０．５ｍｌの単回細胞内用量として投与される２５μｇのＴｙｐｂａｒ－ＴＣＶワクチンを受ける。

保管条件：ワクチンは+2～8℃で保管され、常にコールドチェーンが維持されます。

研究参加者とサンプル収集：研究者は、登録時（1日目）に腸チフス患者（年齢1〜59歳）が疑われる成人から8〜10mlの血液と子供から3〜5mlの血液を採取します。 S.チフス/パラチフスの培養が確認された後、さらに2つの血液サンプル（2〜5日後および27〜33日後）が収集されます。 治験責任医師は、ワクチン接種前 (0 日目) に成人から 8 ～ 10 ml の血液、子供から 3 ～ 5 ml の血液を採取し、7 日目 (6 ～ 8 日後) にワクチン接種を 1 回行った後、さらに 2 つの血液サンプルを採取します [13]。および 30 日目 (27 ～ 33 日後)。 末梢血単核細胞 (PBMC) と好中球を血液サンプルから分離し、さまざまなアッセイに使用します (Polymorphprep キット)。 血漿サンプルは、感染およびワクチン接種に対する抗体反応を測定するために分離されます。

患者管理 臨床医の裁量に応じて、抗生物質およびその他の必要な薬物による患者の治療が提供されます。 腸チフスの培養確認後、抗生物質感受性パターンに応じて抗生物質治療を調整します。 患者が経口抗生物質に反応しない場合は、注射可能な抗生物質を提供します。 患者が注射可能な抗生物質に応答しないままである場合、および/または他の合併症が発生した場合、患者は入院します。 調査官は、別の腸チフス研究を実施しており、患者はミルプールのさまざまな医療施設とダッカ病院の icddr,b に登録されています。 患者の管理は、進行中の他の腸チフス プロジェクトによってサポートされます。

実験室アッセイ手順:

MAIT および NK 細胞アッセイ: 分離された PBMC は、蛍光色素で標識された抗体で染色され、フローサイトメトリーによる表現型解析が実行されます (FACS-Aria で 50000 以上の生細胞を取得)。 MAIT 細胞は、生 (DAPI-) CD3+CD4-CD161hiVα7.2+ として定義されます。 全 CD3+ リンパ球のパーセンテージとして表される細胞、および細胞活性化のマーカーとして使用される CD38。 研究者はまた、生きた CD3+CD8+CD4-CD161loVα7.2+ 細胞の循環頻度を評価します。これは、in vitro でのサイトカイン分泌の欠如または減少に関連する MAIT 由来細胞であることが示唆されています。 CD4+ (ライブ CD3+ CD8-CD4+) 被験者の T 細胞応答は、CD45RA および CD62L の発現によって定義される異なる T メモリー (TM) サブセット、すなわち T セントラル メモリー (TCM; CD45RA-CD62L+)、T エフェクター メモリー ( TEM; CD45RA-CD62L-) および T エフェクター メモリー CD45RA+ (TEMRA; CD45RA+CD62L-)、T 濾胞 (CD3+CXCR5+) およびナイーブ T 細胞 (TN: CD45RA+CD62L+)。 生きたCD3-、CD45+、CD56+、CD69+、CD40L+、CD16+細胞として活性化されたNK細胞、生きたCD3-CD56+CD16+NKp46+CD27+として記憶様NK細胞。

サイトカイン分析: 単離されたリンパ球を S. Typhi 抗原 (全細胞、MP および LPS) で 48 時間および 5 日間刺激し、培養上清を収集し、-70°C で分析するまで保存します。 マルチプレックスビーズアレイ（ルミネックス）を用いて培養上清中のサイトカインを解析する。

ネットの定量化: 好中球は、前述の方法に基づいて末梢血から分離されます。 NETの放出は、好中球NETアッセイキット（NETアッセイキット、Creative Biomart、NY、USA）によって測定されます。 NETosis は、好中球から放出されるエラスターゼのレベルを測定することによって定量化され、NETs を介した殺傷は、細菌の生存率を測定することによって定量化されます。

ＮＥＴ媒介殺傷アッセイ：Ｓ．チフスの殺滅におけるＮＥＴの効率を決定するために、ＣＦＵアッセイが実施される。 一晩培養 S. Typhi は、96 ウェル培養プレートで新たに分離されたヒト好中球と共培養され、37ºC で培養されます。 3時間のインキュベーション後、ウェルを吸引し、PBSで洗浄します。 1:10 および 1:100 の希釈液を作成し、各希釈液 100 μl をブレイン ハート インフュージョン (BHI) 寒天培地に播種します。 培養プレートは、37℃、5% CO2 で培養します。 CFUの数は、24時間のインキュベーション後、およびコロニー数のさらなる増加が観察されなくなるまで培養の3日後にカウントされます。

好中球細胞内代謝物アッセイ：好中球を血液から分離し、回復のために37℃で1時間インキュベートします。 インキュベーション培地を吸引し、1mlのドライアイス(-80℃)冷80%メタノールを加える。 細胞を 1 分間ボルテックスし、15 K rpm で 1 分間遠心分離します。 上清をチューブに集め、使用するまで-80℃で保存します。 分析前にサンプルを-80℃から取り出し、室温に戻します。 上清（75μl）を液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS）バイアルに移し、蓋をします。 10 マイクロリットルのサンプルが、代謝物分離と質量分析のために LC-MS システムに自動ロードされます。

血漿中のリポ多糖 (LPS) に対する抗体応答。 患者およびワクチン接種者におけるS. Typhi LPSに対する血漿抗体反応は、ELISA法を使用して測定されます。 簡単に言えば、96ウェルマイクロタイタープレートをLPSでコーティングし、その後、連続3倍希釈で血漿(1:10希釈)とインキュベートする。 プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトIgA、IgGおよびIgM抗体を加える。 プレートは、0.1% オルト-フェニレンジアミン (OPD) および 0.1% 過酸化水素 (H2O2) を使用して展開され、OD は 492 nm で測定されます。 2 倍以上の抗体応答は、有意な応答と見なされます。

トランスクリプトミクス分析: 成人患者およびワクチン接種者のサブセットから、3 ml の血液が Tempus RNA チューブ (応用バイオシステム) に採取され、血液から RNA が抽出されます。ラボとデータは、次世代 RNA-seq シーケンシングを使用して分析され、遺伝子発現プロファイルが確認されます。 遺伝子発現差は、DESeq パッケージ (Bioconductor) を使用して分析されます。 得られたシーケンス読み取りは、患者/ワクチン接種者と健康なコントロールの間で正規化されます。 比率が 2 より大きく 0.5 より小さい場合、有意と見なされます。