장티푸스 환자와 백신 접종자의 세포 면역 반응

연구 프로젝트 설명: 장티푸스 환자에서 IFN-감마와 IL-17이 증가하는 것으로 이전에 밝혀졌습니다. 장티푸스 감염은 다수의 주요 장티푸스 항원(LPS) HlyE, 편모 단백질 FliC 및 샤페론 단백질 EcpD)에 대한 항체 반응을 유도하는 것으로 나타났습니다. 장 설사병 콜레라에서 MAIT 세포가 활성화되고 관련 LPS 특이적 항체 반응이 생성됩니다. 인간 챌린지 모델 연구에서 CD8+ T 세포 기억 세포가 장티푸스에 대한 보호의 주요 상관관계인 것으로 나타났습니다. 약독화된 장티푸스 생백신(TY21a)도 예방접종 후 MAIT 세포를 유도합니다. IL-12, IL-15, IL-18은 마우스 모델에서 기억 유사 NK 세포를 유도하고 IL-21은 결핵균 감염에 대해 보호하는 기억 유사 NK 세포를 유도하는 것으로 나타났습니다. 장티푸스에서 활성화된 MAIT 세포와 사이토카인 유도 기억 유사 NK 세포의 역할은 현재 알려지지 않았습니다.

호중구가 사용하는 다중 살해 메커니즘 중 하나는 골수페록시다제(MPO), 엘라스타제, 리소자임 및 데펜신을 포함하는 호중구 세포외 트랩(NET)의 방출입니다. 감염은 미생물 병원체를 포획하기 위해 NET의 방출을 유도합니다. 장티푸스 환자로부터 분리된 호중구는 NET를 방출하고 그 호중구 NET 방출은 서브유닛-컨쥬게이트 백신을 사용한 백신접종에 의해 준비됩니다.

연구 개입: Typbar-TCV는 장티푸스 Vi 피막 다당류 파상풍 독소 결합 백신입니다. Typbar-TCV는 임상적으로 입증된 세계 최초의 결합 장티푸스 백신입니다. 이 백신은 WHO 사전 인증을 받았으며 2세 미만의 어린이와 유아용으로 승인되었습니다. 임상 3상 연구에서 Typbar-TCV의 단일 용량은 6개월 이상~2년, >2~15세 및 >15~45세 사이의 대상자에서 98.05%, 99.17% 및 92.13%의 4배 혈청전환율을 이끌어냈습니다. 년 각각. 연구의 백신 접종 부문의 각 지원자는 0.5ml 단일 세포 내 용량으로 투여되는 25ug의 Typbar-TCV 백신을 받게 됩니다.

보관 조건: 백신은 +2-8C에서 보관되며 콜드 체인은 항상 유지됩니다.

연구 참가자 및 샘플 수집: 조사자는 등록(1일) 및 환자가 S. Typhi/Paratyphi 배양이 확인된 후 2개의 추가 혈액 샘플(2-5일 및 27-33일 후)을 수집합니다. 접종 전(0일차) 성인 혈액 8~10ml, 어린이 혈액 3~5ml, 접종 7일차(6~8일 후) 1회 혈액 검체 2개 추가 채취 [13] 및 30일째(27-33일 후). 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 호중구는 혈액 샘플에서 분리되어 다양한 분석에 사용됩니다(Polymorphprep 키트). 혈장 샘플은 감염 및 백신 접종에 대한 항체 반응을 측정하기 위해 분리됩니다.

환자 관리 임상의의 판단에 따라 항생제 및 기타 필요한 약물로 환자를 치료합니다. 장티푸스 배양 확인 후 항생제 감수성 패턴에 따라 항생제 치료를 조정합니다. 환자가 경구용 항생제에 반응하지 않으면 주사 가능한 항생제를 투여합니다. 환자가 주사 가능한 항생제에 반응하지 않거나 다른 합병증이 발생하면 환자는 입원하게 됩니다. 조사관은 환자가 Mirpur 및 icddr,b Dhaka 병원의 다른 의료 시설에 등록된 또 다른 장티푸스 연구를 수행하고 있습니다. 환자 관리는 진행 중인 다른 장티푸스 프로젝트에 의해 지원될 것입니다.

실험실 분석 절차:

MAIT 및 NK 세포 분석: 분리된 PBMC는 형광색소 표지 항체로 염색되고 유세포 분석 표현형 분석이 수행됩니다(FACS-Aria에서 50000개 이상의 살아있는 세포 획득). MAIT 세포는 살아있는(DAPI-) CD3+CD4-CD161hiVα7.2+로 정의됩니다. 총 CD3+ 림프구의 백분율로 표시되는 세포, 및 세포 활성화의 마커로 사용되는 CD38. 조사관은 또한 시험관 내에서 사이토카인 분비가 없거나 감소된 MAIT 유래 세포로 제안된 순환하는 살아있는 CD3+CD8+CD4-CD161loVα7.2+ 세포의 빈도를 평가할 것입니다. 연구 대상의 CD4+(생 CD3+ CD8-CD4+) T 세포 반응은 CD45RA 및 CD62L의 발현에 의해 정의되는 상이한 T 메모리(TM) 서브세트, 즉 T 중앙 메모리(TCM; CD45RA-CD62L+), T 효과기 메모리( TEM, CD45RA-CD62L-) 및 T 이펙터 메모리 CD45RA+(TEMRA; CD45RA+CD62L-), T 소낭(CD3+CXCR5+) 및 나이브 T 세포(TN: CD45RA+CD62L+). 살아있는 CD3-, CD45+, CD56+, CD69+, CD40L+, CD16+ 세포로 활성화된 NK 세포 및 살아있는 CD3-CD56+CD16+NKp46+CD27+로 NK 세포와 같은 기억.

사이토카인 분석: 분리된 림프구를 48시간 및 5일 동안 S. Typhi 항원(전체 세포, MP 및 LPS)으로 자극하고 배양 상청액을 수집하여 -70°C에서 분석할 때까지 보관합니다. 배양 상등액의 사이토카인은 다중 비드 어레이(Luminex)를 사용하여 분석합니다.

NET의 정량화: 이전에 설명한 방법에 따라 말초 혈액에서 호중구를 분리합니다. NET의 방출은 호중구 NET 분석 키트(NET 분석 키트, Creative Biomart, NY, USA)로 측정됩니다. NETosis는 호중구에서 방출되는 엘라스타제의 수준을 측정하여 정량화하고 NET 매개 살상은 박테리아의 생존력을 측정하여 정량화합니다.

NET 매개 살상 검정: 장티푸스균을 죽이는 NET의 효율성을 결정하기 위해 CFU 검정을 수행합니다. 하룻밤 배양 S. Typhi는 96-웰 배양 플레이트에서 새로 분리된 인간 호중구와 함께 배양되고 37ºC에서 배양됩니다. 배양 3시간 후, 웰을 흡입하고 PBS로 세척합니다. 1:10 및 1:100의 희석이 이루어지고 각 희석의 100 μl가 Brain Heart Infusion(BHI) 한천에 도금됩니다. 배양 플레이트는 37ºC, 5% CO2에서 배양됩니다. CFU의 수는 배양 24시간 후 및 배양 3일 후에 콜로니 수의 추가 증가가 관찰되지 않을 때까지 계산됩니다.

호중구 세포내 대사산물 분석: 호중구는 혈액에서 분리되고 회수를 위해 37ºC에서 1시간 동안 배양됩니다. 배양 배지를 흡인하고 드라이아이스(-80ºC)의 차가운 80% 메탄올 1ml를 추가합니다. 세포를 1분 동안 vortex한 다음 15K rpm에서 1분 동안 원심분리합니다. 상청액은 튜브에 모아서 사용할 때까지 -80ºC에서 보관합니다. 분석 전 시료는 -80ºC에서 꺼내어 실온과 평형을 이루도록 합니다. 상청액(75μl)을 뚜껑이 있는 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS) 바이알로 옮깁니다. 10마이크로리터의 샘플이 대사산물 분리 및 질량 분석 분석을 위해 LC-MS 시스템에 자동으로 로드됩니다.

혈장 내 지질다당류(LPS)에 대한 항체 반응. 환자 및 백신접종자의 S. Typhi LPS에 대한 혈장 항체 반응은 ELISA 방법을 사용하여 측정됩니다. 간략하게, 96-웰 마이크로타이터 플레이트는 LPS로 코팅되고 이후 일련의 3배 희석과 함께 혈장(1:10 희석)과 함께 배양됩니다. 플레이트를 세척하고 서양고추냉이 과산화효소 접합 항인간 IgA, IgG 및 IgM 항체를 추가합니다. 플레이트는 0.1% 오르토-페닐렌 디아민(OPD) 및 0.1% 과산화수소(H2O2)를 사용하여 현상되고 OD는 492nm에서 측정됩니다. 2배 이상의 항체 반응은 유의한 반응으로 간주됩니다.

Transcriptomics 분석: 성인 환자 및 백신 접종자의 하위 집합에서 Tempus RNA 튜브(응용 바이오 시스템)에 3ml 혈액을 수집하고 혈액에서 RNA를 추출합니다. 실험실 및 데이터는 차세대 RNA-seq 시퀀싱을 사용하여 유전자 발현 프로필을 확인하기 위해 분석됩니다. 차등 유전자 발현은 DESeq 패키지(Bioconductor)를 사용하여 분석됩니다. 얻어진 서열 판독은 환자/백신 대 건강한 대조군 사이에서 정규화될 것이다. 2보다 크고 0.5보다 낮은 비율은 중요한 것으로 간주됩니다.