Komórkowe odpowiedzi immunologiczne u pacjentów z tyfusem i szczepionych

Opis projektu badawczego: Wcześniej wykazano, że IFN-gamma i IL-17 są podwyższone u pacjentów z durem brzusznym. Wykazano, że infekcja S. Typhi indukuje odpowiedzi przeciwciał przeciwko wielu kluczowym antygenom duru brzusznego (LPS) HlyE, białku wiciowemu FliC i białku opiekuńczemu EcpD). W przypadku cholery z biegunką jelitową komórki MAIT są aktywowane i generowane są związane z nimi odpowiedzi przeciwciał swoistych dla LPS. W badaniu modelu prowokacji u ludzi wykazano, że komórki pamięci komórek T CD8 + są kluczowymi korelatami ochrony przed durem brzusznym. Żywa atenuowana szczepionka przeciw durowi brzusznemu (TY21a) również indukuje komórki MAIT po immunizacji. Wykazano, że IL-12, IL-15, IL-18 indukują komórki NK przypominające pamięć w modelu mysim, a IL-21 indukuje komórki NK przypominające pamięć, chroniące przed infekcją Mycobacterium tuberculosis. Rola aktywowanych komórek MAIT i indukowanych cytokinami komórek NK przypominających pamięć w durze brzusznym jest obecnie nieznana.

Jednym z mechanizmów wielokrotnego zabijania stosowanych przez neutrofile jest uwalnianie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET), które zawierają mieloperoksydazę (MPO), elastazę, lizozym i defenzyny. Zakażenie indukuje uwalnianie NET w celu wyłapania drobnoustrojów chorobotwórczych. Neutrofile wyizolowane od pacjentów z durem brzusznym uwalniają NET i to uwalnianie NET neutrofili jest pobudzane przez szczepienie szczepionką skoniugowaną z podjednostkami.

Interwencja w badaniu: Typbar-TCV to skoniugowana szczepionka otoczkowa z polisacharydem tężcowym i toksoidem tyfusu Vi. Typbar-TCV to pierwsza na świecie klinicznie potwierdzona skoniugowana szczepionka przeciw durowi brzusznemu. Ta szczepionka została wstępnie zakwalifikowana przez WHO i zatwierdzona dla dzieci i niemowląt w wieku poniżej 2 lat. Podczas badania klinicznego III fazy pojedyncza dawka szczepionki Typbar-TCV wywołała 4-krotny współczynnik serokonwersji wynoszący 98,05%, 99,17% i 92,13% u pacjentów w wieku od ponad 6 miesięcy do 2 lat, >2 do 15 lat i >15 do 45 odpowiednio lat. Każdy ochotnik w grupie szczepienia w badaniu otrzyma 25 μg szczepionki Typbar-TCV podanej jako pojedyncza dawka wewnątrzkomórkowa 0,5 ml.

Warunki przechowywania: Szczepionka będzie przechowywana w temperaturze +2-8°C, a łańcuch chłodniczy będzie utrzymywany przez cały czas.

Uczestnicy badania i pobieranie próbek: Badacze pobiorą 8-10 ml krwi od dorosłych i 3-5 ml krwi od dzieci, u których w dniu rejestracji (1. Po potwierdzeniu hodowli S. Typhi/Paratyphi zostaną pobrane jeszcze dwie próbki krwi (2-5 dni i 27-33 dni później). Badacze pobiorą 8-10 ml krwi od dorosłych i 3-5 ml krwi od dzieci przed szczepieniem (dzień 0) oraz dwie kolejne próbki krwi po jednej dawce szczepionki w dniu 7 (6-8 dni później) [13]. iw dniu 30 (27-33 dni później). Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) i neutrofile zostaną wyizolowane z próbek krwi i użyte do różnych testów (zestaw Polymorphprep). Próbki osocza zostaną rozdzielone w celu zmierzenia odpowiedzi przeciwciał na infekcję i szczepienie.

Postępowanie z pacjentem W zależności od uznania lekarza zostanie zapewnione leczenie pacjenta antybiotykiem i innymi niezbędnymi lekami. Po potwierdzeniu posiewu duru brzusznego antybiotykoterapia zostanie dostosowana w zależności od wzorca wrażliwości na antybiotyki. Jeśli pacjent nie zareaguje na antybiotyk doustny, podamy antybiotyk w zastrzykach. Jeśli pacjent nie zareaguje na wstrzykiwany antybiotyk i/lub wystąpią inne komplikacje, wówczas pacjent zostanie hospitalizowany. Badacze prowadzą kolejne badanie dotyczące duru brzusznego, w którym pacjenci są zapisani do różnych placówek służby zdrowia w Mirpur, a także do szpitala icddr, b Dhaka. Zarządzanie pacjentami będzie wspierane przez inny trwający projekt dotyczący duru brzusznego.

Procedura testu laboratoryjnego:

Test komórek MAIT i NK: Izolowane PBMC zostaną wybarwione przeciwciałami znakowanymi fluorochromem i przeprowadzone zostanie fenotypowanie metodą cytometrii przepływowej (akwizycja ≥50000 żywych komórek na FACS-Aria). Komórki MAIT zostaną zdefiniowane jako żywe (DAPI-) CD3+CD4-CD161hiVα7.2+ komórek, wyrażone jako procent całkowitej liczby limfocytów CD3+ i CD38 stosowane jako marker aktywacji komórek. Badacze ocenią również częstość krążących żywych komórek CD3+CD8+CD4-CD161loVα7.2+, które, jak sugerowano, są komórkami pochodzącymi z MAIT związanymi z brakiem lub zmniejszonym wydzielaniem cytokin in vitro. CD4+ (żywe CD3+ CD8-CD4+) Odpowiedzi limfocytów T u badanych osób zostaną ocenione w różnych podzbiorach pamięci T (TM) zdefiniowanych na podstawie ich ekspresji CD45RA i CD62L, tj. pamięci centralnej T (TCM; CD45RA-CD62L+), pamięci efektorowej T ( TEM; CD45RA-CD62L-) i efektorowe komórki pamięci T CD45RA+ (TEMRA; CD45RA+CD62L-), T pęcherzykowe (CD3+CXCR5+) i naiwne limfocyty T (TN: CD45RA+CD62L+). Aktywowane komórki NK jako żywe komórki CD3-, CD45+, CD56+, CD69+, CD40L+, CD16+ i komórki pamięci podobne do komórek NK jako żywe komórki CD3-CD56+CD16+NKp46+CD27+.

Analiza cytokin: Wyizolowane limfocyty będą stymulowane antygenami S. Typhi (całe komórki, MP i LPS) przez 48 godzin, jak również przez 5 dni, a supernatant hodowli będzie zbierany i przechowywany do czasu analizy w temperaturze -70°C. Cytokiny w supernatancie hodowli będą analizowane przy użyciu multipleksowej matrycy kulek (Luminex).

Oznaczenie ilościowe NET: Neutrofile zostaną wyizolowane z krwi obwodowej na podstawie wcześniej opisanej metody. Uwalnianie NET będzie mierzone za pomocą zestawu testowego NET neutrofilów (zestaw testowy NET, Creative Biomart, NY, USA). NETosis zostanie określony ilościowo poprzez pomiar poziomów elastazy, która jest uwalniana z neutrofili, a zabijanie, w którym pośredniczą NET, zostanie określone ilościowo poprzez pomiar żywotności bakterii.

Test zabijania za pośrednictwem NET: Aby określić skuteczność NET w zabijaniu S. Typhi, zostanie przeprowadzony test CFU. Nocna hodowla S. Typhi będzie inkubowana razem ze świeżo wyizolowanymi ludzkimi neutrofilami w 96-dołkowej płytce hodowlanej i inkubowana w 37ºC. Po 3 godzinach inkubacji studzienki zostaną odessane i przemyte PBS. Sporządzone zostaną rozcieńczenia 1:10 i 1:100 i 100 µl każdego rozcieńczenia zostanie umieszczone na agarze Brain Heart Infusion (BHI). Płytki hodowlane będą inkubowane w temperaturze 37ºC z 5% CO2. Liczba CFU zostanie zliczona po 24 godzinach inkubacji i po 3 dniach hodowli, aż do zaprzestania obserwowania dalszego wzrostu liczby kolonii.

Test wewnątrzkomórkowego metabolitu neutrofili: Neutrofile zostaną wyizolowane z krwi i inkubowane w temperaturze 37ºC przez 1 godzinę w celu odzyskania. Pożywka inkubacyjna zostanie odessana i dodany zostanie 1 ml suchego lodu (-80°C) zimnego 80% metanolu. Komórki będą wirowane przez 1 minutę, a następnie wirowane przy 15 K rpm przez 1 minutę. Supernatant będzie zbierany do probówek i przechowywany w temperaturze -80ºC do momentu użycia. Przed analizą próbki zostaną wyjęte z -80ºC i pozostawione do zrównoważenia do temperatury pokojowej. Supernatant (75 µl) przeniesie się do zakorkowanej fiolki do chromatografii cieczowej-tandemowej spektrometrii mas (LC-MS). Dziesięć mikrolitrów próbki zostanie automatycznie załadowanych do systemu LC-MS w celu oddzielenia metabolitów i analizy spektrometrii mas.

Odpowiedzi przeciwciał na lipopolisacharyd (LPS) w osoczu. Odpowiedzi przeciwciał w osoczu na S. Typhi LPS u pacjentów i zaszczepionych będą mierzone metodami ELISA. Pokrótce, 96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania zostaną pokryte LPS i inkubowane z osoczem (rozcieńczenie 1:10), a następnie seryjne 3-krotne rozcieńczenia. Płytki zostaną przemyte i dodane zostaną przeciwciała anty-ludzkie IgA, IgG i IgM skoniugowane z peroksydazą chrzanową. Płytki zostaną wywołane przy użyciu 0,1% orto-fenylenodiaminy (OPD) i 0,1% nadtlenku wodoru (H2O2), a OD zostanie zmierzona przy 492 nm. Dwukrotna lub wyższa odpowiedź przeciwciał będzie uważana za znaczącą odpowiedź.

Analiza transkryptomiczna: Od podgrupy dorosłych pacjentów i zaszczepionych zostanie pobrane 3 ml krwi do probówek Tempus RNA (aplikowany biosystem) i RNA zostanie wyekstrahowane z krwi, sekwencjonowanie transkryptomiczne zostanie przeprowadzone w Shanghi w Chinach (BGI), które jest usługą świadczącą laboratorium, a dane zostaną przeanalizowane przy użyciu sekwencjonowania sekwencji RNA nowej generacji, aby zobaczyć profil ekspresji genów. Zróżnicowana ekspresja genów będzie analizowana przy użyciu pakietu DESeq (Bioconductor). Uzyskane odczyty sekwencji zostaną znormalizowane między pacjentami/szczepionkami a zdrowymi kontrolami. Stosunek większy niż 2 i niższy niż 0,5 będzie uważany za istotny.