Solu-immuunivasteet lavantautipotilailla ja rokotetuilla

Tutkimusprojektin kuvaus: Aiemmin on osoitettu, että IFN-gamma ja IL-17 ovat lisääntyneet lavantautipotilailla. Osoitettiin, että S. Typhi -infektio indusoi vasta-ainevasteita useita keskeisiä lavantautien antigeenejä (LPS) HlyE, Flagellar-proteiini FliC ja chaperon-proteiini EcpD vastaan. Suolistoripulitaudin kolerassa MAIT-solut aktivoituvat ja niihin liittyvät LPS-spesifiset vasta-ainevasteet muodostuvat. Ihmisellä tehdyssä altistusmallitutkimuksessa on osoitettu, että CD8+ T-solumuistisolut ovat keskeisiä korrelaatteja suojaamisessa lavantautia vastaan. Elävä heikennetty lavantautirokote (TY21a) indusoi myös MAIT-soluja immunisoinnin jälkeen. On osoitettu, että IL-12, IL-15, IL-18 indusoivat muistin kaltaisia ​​NK-soluja hiirimallissa ja IL-21 indusoi muistin kaltaisia ​​NK-soluja, jotka suojaavat Mycobacterium tuberculosis -infektiolta. Aktivoituneiden MAIT-solujen ja sytokiinien aiheuttamien muistin kaltaisten NK-solujen roolia lavantautissa ei tällä hetkellä tunneta.

Yksi neutrofiilien useista tappamismekanismeista on myeloperoksidaasia (MPO), elastaasia, lysotsyymiä ja defensiinejä sisältävien neutrofiilien ekstrasellulaaristen ansojen (NET) vapautuminen. Infektio saa aikaan NET:ien vapautumista mikrobipatogeenien vangitsemiseksi. Lavantautipotilaista eristetyt neutrofiilit vapauttavat NET-soluja ja että neutrofiilien NET-vapautuminen pohjustetaan rokottamalla alayksikkökonjugaattirokotteella.

Tutkimusinterventio: Typbar-TCV on typhoid Vi -kapselipolysakkaridi-tetanustoksoidikonjugaattirokote. Typbar-TCV on maailman ensimmäinen kliinisesti todistettu konjugoitu lavantautirokote. Tämä rokote on WHO:n ennalta hyväksymä ja hyväksytty alle 2-vuotiaille lapsille ja vauvoille. Vaiheen III kliinisen tutkimuksen aikana kerta-annos Typbar-TCV:tä sai aikaan nelinkertaiset serokonversioluvut 98,05 %, 99,17 % ja 92,13 % yli 6 kuukauden - 2 vuoden, > 2 - 15 vuoden ja > 15 - 45 vuoden ikäisillä. vuotta vastaavasti. Jokainen tutkimuksen rokotushaarassa oleva vapaaehtoinen saa 25 ug Typbar-TCV-rokotetta 0,5 ml:n kerta-annoksena solunsisäisenä annoksena.

Varastointiolosuhteet: Rokotetta säilytetään +2-8C ja kylmäketjua ylläpidetään koko ajan.

Tutkimukseen osallistujat ja näytteenotto: Tutkijat keräävät 8-10 ml verta aikuisilta ja 3-5 ml verta lapsilta, joilla epäillään lavantautipotilaita (ikä 1-59 vuotta) ilmoittautumisen yhteydessä (päivä 1) ja jos potilas on S. Typhi/Paratyphi -viljelmä varmistettu, sitten otetaan vielä kaksi verinäytettä (2-5 päivää ja 27-33 päivää myöhemmin). Tutkijat keräävät 8-10 ml verta aikuisilta ja 3-5 ml verta lapsilta ennen rokotusta (päivä 0) ja vielä kaksi verinäytettä yhden rokotusannoksen jälkeen päivänä 7 (6-8 päivää myöhemmin) [13] ja päivänä 30 (27-33 päivää myöhemmin). Perifeerisen veren mononukleaarisolut (PBMC:t) ja neutrofiilit eristetään verinäytteistä ja niitä käytetään erilaisiin määrityksiin (Polymorphprep Kit). Plasmanäytteet erotetaan infektion ja rokotuksen vasta-ainevasteen mittaamiseksi.

Potilashoito Lääkärin harkinnan mukaan potilaalle tarjotaan antibioottihoitoa ja muita tarvittavia lääkkeitä. Lavantautien viljelyn vahvistuksen jälkeen antibioottihoitoa säädetään antibioottiherkkyysmallin mukaan. Jos potilas ei reagoi oraaliseen antibioottihoitoon, tarjoamme ruiskeena annettavan antibiootin. Jos potilas ei reagoi ruiskeena annettavaan antibioottihoitoon ja/tai ilmenee muita komplikaatioita, potilas viedään sairaalaan. Tutkijat suorittavat toista lavantautitutkimusta, jossa potilaat ovat Mirpurin eri terveydenhuoltolaitoksissa ja myös icddr,b Dhakan sairaalassa. Potilashoitoa tuetaan muulla meneillään olevalla lavantautiprojektilla.

Laboratoriomääritysmenettely:

MAIT- ja NK-solumääritys: Eristetyt PBMC:t värjätään fluorokromilla leimatuilla vasta-aineilla ja suoritetaan virtaussytometrinen fenotyypitys (≥50 000 elävän solun hankinta FACS-Ariasta). MAIT-solut määritellään eläviksi (DAPI-) CD3+CD4-CD161hiVα7.2+ solut, ilmaistuna prosentteina CD3+-lymfosyyttien kokonaismäärästä, ja CD38, jota käytettiin soluaktivaation markkerina. Tutkijat arvioivat myös kiertävien elävien CD3+CD8+CD4-CD161loVα7.2+-solujen esiintymistiheyden, joiden on ehdotettu olevan MAIT-peräisiä soluja, jotka liittyvät puuttuvaan tai vähentyneeseen sytokiinieritykseen in vitro. CD4+ (elävät CD3+ CD8-CD4+) T-soluvasteet tutkimushenkilöillä arvioidaan erilaisissa T-muistin (TM) alaryhmissä, jotka määritellään niiden CD45RA:n ja CD62L:n ilmentymisen perusteella, eli T-keskusmuistissa (TCM; CD45RA-CD62L+), T-efektorimuistissa ( TEM; CD45RA-CD62L-) ja T-efektorimuisti CD45RA+ (TEMRA; CD45RA+CD62L-), T-follikulaari (CD3+CXCR5+) ja naiivit T-solut (TN: CD45RA+CD62L+). Aktivoitunut NK-solu elävinä CD3-, CD45+, CD56+, CD69+, CD40L+, CD16+ soluina ja muisti, kuten NK-solu elävinä CD3-CD56+CD16+NKp46+CD27+.

Sytokiinianalyysi: Eristettyjä lymfosyyttejä stimuloidaan S. Typhi -antigeeneillä (kokosolu, MP ja LPS) 48 tunnin ajan sekä 5 päivän ajan ja viljelmän supernatantti kerätään ja säilytetään, kunnes ne analysoidaan -70 °C:ssa. Viljelmän supernatantissa olevat sytokiinit analysoidaan käyttämällä multiplex bead arrayä (Luminex).

NET:ien kvantifiointi: Neutrofiilit eristetään ääreisverestä aiemmin kuvatulla menetelmällä. NET:ien vapautuminen mitataan neutrofiilien NET-määrityssarjalla (NET assay kit, Creative Biomart, NY, USA). NEToosi kvantifioidaan mittaamalla neutrofiileistä vapautuvan elastaasin tasot ja NET-välitteinen tappaminen määritetään mittaamalla bakteerien elinkelpoisuus.

NETs-välitteinen tappamismääritys: NET:ien tehokkuuden määrittämiseksi S. Typhin tappamisessa suoritetaan CFU-määritys. Yön yli viljelmä S. Typhiä inkuboidaan yhdessä juuri eristettyjen ihmisen neutrofiilien kanssa 96-kuoppaisella viljelylevyllä ja inkuboidaan 37 °C:ssa. 3 tunnin inkubaation jälkeen kuopat imetään ja pestään PBS:llä. Laimennokset 1:10 ja 1:100 tehdään ja 100 µl kutakin laimennosta maljataan Brain Heart Infusion (BHI) -agarille. Viljelylevyjä inkuboidaan 37 ºC:ssa 5 % CO2:n kanssa. CFU:iden lukumäärä lasketaan 24 tunnin inkubaation jälkeen ja 3 päivän viljelyn jälkeen, kunnes pesäkkeiden lukumäärää ei enää havaita.

Neutrofiilien solunsisäinen metaboliittimääritys: Neutrofiilit eristetään verestä ja niitä inkuboidaan 37 ºC:ssa 1 tunnin ajan palautumista varten. Inkubointiväliaine imetään ja 1 ml kuivajäätä (-80 ºC) kylmää 80 % metanolia lisätään. Soluja vorteksoidaan 1 minuutin ajan ja sitten sentrifugoidaan 15 K rpm 1 minuutin ajan. Supernatantti kerätään putkiin ja säilytetään -80 ºC:ssa käyttöön asti. Ennen analysointia näytteet otetaan -80 ºC:sta ja niiden annetaan tasapainottua huoneenlämpötilaan. Supernatantti (75 µl) siirretään nestekromatografia-tandem-massaspektrometria (LC-MS) -pulloon, joka on korkki. Kymmenen mikrolitraa näytettä ladataan automaattisesti LC-MS-järjestelmään metaboliittien erottamista ja massaspektrometristä analyysiä varten.

Vasta-ainevasteet lipopolysakkaridille (LPS) plasmassa. Plasman vasta-ainevasteet S. Typhi LPS:lle potilailla ja rokotetuilla mitataan ELISA-menetelmillä. Lyhyesti sanottuna 96-kuoppaiset mikrotiitterilevyt päällystetään LPS:llä ja inkuboidaan plasman kanssa (1:10-laimennos) 3-kertaisilla laimennoksilla sen jälkeen. Levyt pestään ja piparjuuriperoksidaasiin konjugoituja ihmisen IgA-, IgG- ja IgM-vasta-aineita lisätään. Levyt kehitetään käyttämällä 0,1 % ortofenyleenidiamiinia (OPD) ja 0,1 % vetyperoksidia (H2O2), ja OD mitataan 492 nm:ssä. Kaksinkertainen tai suurempi vasta-ainevaste katsotaan merkittäväksi vasteeksi.

Transkriptominen analyysi: Aikuisten potilaiden ja rokotettujen osajoukosta kerätään 3 ml verta Tempus RNA -putkiin (sovellettu biosysteemi) ja RNA uutetaan verestä, transkriptiominen sekvensointi tehdään Shanghissa, Kiinassa (BGI), joka tarjoaa palvelua. laboratorio ja tiedot analysoidaan käyttämällä seuraavan sukupolven RNA-sekvenssin sekvensointia geenin ilmentymisprofiilin näkemiseksi. Differentiaalinen geeniekspressio analysoidaan käyttämällä DESeq-pakettia (Bioconductor). Saadut sekvenssilukemat normalisoidaan potilaiden/rokotettujen ja terveiden kontrollien välillä. Suhdesuhdetta, joka on suurempi kuin 2 ja pienempi kuin 0,5, pidetään merkittävänä.