Zelluläre Immunantworten bei Typhuspatienten und Impfstoffen

Beschreibung des Forschungsprojekts: Es wurde bereits früher gezeigt, dass IFN-gamma und IL-17 bei Typhuspatienten erhöht sind. Es wurde gezeigt, dass eine S. Typhi-Infektion Antikörperreaktionen gegen eine Reihe wichtiger Typhus-Antigene (LPS) (HlyE, Flagellar-Protein FliC und Chaperon-Protein EcpD) induziert. Bei der Darmdurchfallerkrankung Cholera werden MAIT-Zellen aktiviert und damit verbundene LPS-spezifische Antikörperantworten erzeugt. In einer Human-Challenge-Modellstudie wurde gezeigt, dass CD8+ T-Zell-Gedächtniszellen Schlüsselkorrelate des Schutzes gegen Typhus sind. Der abgeschwächte Typhus-Lebendimpfstoff (TY21a) induziert nach der Immunisierung ebenfalls MAIT-Zellen. Es wurde gezeigt, dass IL-12, IL-15, IL-18 gedächtnisähnliche NK-Zellen in einem Mausmodell induzieren und IL-21 gedächtnisähnliche NK-Zellen induziert, die vor einer Infektion mit Mycobacterium tuberculosis schützen. Die Rolle von aktivierten MAIT-Zellen und zytokininduzierten gedächtnisähnlichen NK-Zellen bei Typhus ist derzeit unbekannt.

Einer der mehrfachen Abtötungsmechanismen, die von Neutrophilen eingesetzt werden, ist die Freisetzung von extrazellulären Neutrophilenfallen (NETs), die Myeloperoxidase (MPO), Elastase, Lysozym und Defensine enthalten. Die Infektion induziert die Freisetzung von NETs, ​​um mikrobielle Pathogene einzufangen. Aus Typhuspatienten isolierte Neutrophile setzen NETs frei, und diese Neutrophilen-NET-Freisetzung wird durch Impfung mit einem Untereinheiten-Konjugat-Impfstoff ausgelöst.

Studienintervention: Typbar-TCV ist ein Typhoid-Vi-Kapselpolysaccharid-Tetanustoxoid-Konjugatimpfstoff. Typbar-TCV ist der weltweit erste klinisch erprobte Typhus-Konjugatimpfstoff. Dieser Impfstoff ist von der WHO vorqualifiziert und für Kinder und Säuglinge unter 2 Jahren zugelassen. Während der klinischen Phase-III-Studie führte eine Einzeldosis Typbar-TCV zu 4-fachen Serokonversionsraten von 98,05 %, 99,17 % und 92,13 % bei Patienten zwischen mehr als 6 Monaten bis 2 Jahren, > 2 bis 15 Jahren und > 15 bis 45 Jahren Jahren bzw. Jeder Freiwillige im Impfarm der Studie erhält 25 ug Typbar-TCV-Impfstoff, verabreicht als intrazelluläre Einzeldosis von 0,5 ml.

Lagerbedingungen: Der Impfstoff wird bei +2-8 °C gelagert und die Kühlkette wird jederzeit aufrechterhalten.

Studienteilnehmer und Probenentnahme: Die Prüfärzte werden 8–10 ml Blut von Erwachsenen und 3–5 ml Blut von Kindern sammeln, bei denen es sich um Patienten mit Verdacht auf Typhus (Alter 1–59 Jahre) bei der Aufnahme (Tag 1) handelt und falls es sich um einen Patienten handelt S. Typhi/Paratyphi-Kultur bestätigt, dann werden zwei weitere Blutproben (2-5 Tage und 27-33 Tage später) entnommen. Die Ermittler werden 8-10 ml Blut von Erwachsenen und 3-5 ml Blut von Kindern vor der Impfung (Tag 0) und zwei weitere Blutproben nach einer Impfdosis am Tag 7 (6-8 Tage später) entnehmen [13]. und am Tag 30 (27–33 Tage später). Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) und Neutrophile werden aus Blutproben isoliert und für verschiedene Assays (Polymorphprep-Kit) verwendet. Plasmaproben werden getrennt, um die Antikörperreaktion auf Infektionen und Impfungen zu messen.

Patientenmanagement Je nach Ermessen des Arztes wird der Patient mit Antibiotika und anderen notwendigen Medikamenten behandelt. Nach kultureller Bestätigung von Typhus wird die antibiotische Behandlung je nach antibiotischem Empfindlichkeitsmuster angepasst. Wenn der Patient nicht auf das orale Antibiotikum anspricht, werden wir ein injizierbares Antibiotikum bereitstellen. Wenn der Patient auf das injizierbare Antibiotikum nicht anspricht und/oder andere Komplikationen auftreten, wird der Patient ins Krankenhaus eingeliefert. Die Ermittler führen eine weitere Typhusstudie durch, bei der die Patienten in verschiedenen Gesundheitseinrichtungen in Mirpur und im icddr,b-Krankenhaus in Dhaka aufgenommen werden. Das Patientenmanagement wird durch andere laufende Typhusprojekte unterstützt.

Labortestverfahren:

MAIT- und NK-Zell-Assay: Isolierte PBMCs werden mit Fluorochrom-markierten Antikörpern gefärbt und eine durchflusszytometrische Phänotypisierung durchgeführt (Erfassung von ≥50000 lebenden Zellen auf einem FACS-Aria). MAIT-Zellen werden als lebende (DAPI-) CD3+CD4-CD161hiVα7.2+ definiert Zellen, ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten CD3+-Lymphozyten, und CD38, das als Marker der Zellaktivierung verwendet wird. Die Forscher werden auch die Häufigkeit zirkulierender lebender CD3+CD8+CD4-CD161loVα7.2+-Zellen bewerten, bei denen es sich vermutlich um MAIT-abgeleitete Zellen handelt, die mit einer fehlenden oder reduzierten Zytokinsekretion in vitro assoziiert sind. CD4+ (live CD3+ CD8-CD4+) T-Zell-Antworten bei Studienteilnehmern werden in verschiedenen Untergruppen des T-Gedächtnisses (TM) bewertet, die durch ihre Expression von CD45RA und CD62L definiert sind, d. TEM; CD45RA-CD62L-) und T-Effektor-Gedächtnis CD45RA+ (TEMRA; CD45RA+CD62L-), follikuläre T-Zellen (CD3+CXCR5+) und naive T-Zellen (TN: CD45RA+CD62L+). Aktivierte NK-Zellen als lebende CD3-, CD45+-, CD56+-, CD69+-, CD40L+-, CD16+-Zellen und Gedächtnis-ähnliche NK-Zellen als lebende CD3-CD56+CD16+NKp46+CD27+.

Zytokinanalyse: Isolierte Lymphozyten werden mit S. Typhi-Antigenen (Ganzzellen, MP und LPS) für 48 Stunden sowie für 5 Tage stimuliert und der Kulturüberstand wird gesammelt und bis zur Analyse bei -70 °C gelagert. Zytokine im Kulturüberstand werden unter Verwendung eines Multiplex-Bead-Arrays (Luminex) analysiert.

Quantifizierung von NETs: Neutrophile werden basierend auf dem zuvor beschriebenen Verfahren aus peripherem Blut isoliert. Die Freisetzung von NETs wird mit einem Neutrophilen-NET-Assay-Kit (NET-Assay-Kit, Creative Biomart, NY, USA) gemessen. NETose wird quantifiziert, indem die Elastase-Spiegel gemessen werden, die von Neutrophilen freigesetzt werden, und die durch NETs vermittelte Abtötung wird quantifiziert, indem die Lebensfähigkeit von Bakterien gemessen wird.

NETs-vermittelter Abtötungsassay: Um die Effizienz von NETs beim Abtöten von S. Typhi zu bestimmen, wird ein CFU-Assay durchgeführt. Übernachtkultur S. Typhi wird mit frisch isolierten humanen Neutrophilen in einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen co-inkubiert und bei 37 °C inkubiert. Nach 3 Stunden Inkubation werden die Wells abgesaugt und mit PBS gewaschen. Es werden Verdünnungen von 1:10 und 1:100 hergestellt und 100 &mgr;l jeder Verdünnung werden auf Hirn-Herz-Infusions(BHI)-Agar plattiert. Kulturplatten werden bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Die Anzahl der KBE wird nach 24 Stunden Inkubation und nach 3 Tagen Kultivierung gezählt, bis keine weitere Zunahme der Koloniezahlen beobachtet wird.

Assay für intrazelluläre Metaboliten von Neutrophilen: Neutrophile werden aus dem Blut isoliert und zur Erholung 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Das Inkubationsmedium wird abgesaugt und 1 ml Trockeneis (-80 °C) kaltes 80 %iges Methanol wird hinzugefügt. Die Zellen werden 1 Minute lang gevortext und dann 1 Minute lang bei 15 K U/min zentrifugiert. Der Überstand wird in Röhrchen gesammelt und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert. Vor der Analyse werden die Proben von -80 °C entfernt und auf Raumtemperatur gebracht. Der Überstand (75 ul) wird in ein Fläschchen mit Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS) mit Deckel überführt. Zehn Mikroliter der Probe werden automatisch in das LC-MS-System zur Metabolitentrennung und massenspektrometrischen Analyse geladen.

Antikörperreaktionen auf Lipopolysaccharid (LPS) im Plasma. Plasma-Antikörperreaktionen auf S. Typhi LPS bei Patienten und Impflingen werden mit ELISA-Methoden gemessen. Kurz gesagt, Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen werden mit LPS beschichtet und mit Plasma (1:10-Verdünnung) mit seriellen 3-fachen Verdünnungen danach inkubiert. Die Platten werden gewaschen und Meerrettichperoxidase-konjugierte Anti-Human-IgA-, -IgG- und -IgM-Antikörper werden hinzugefügt. Die Platten werden mit 0,1 % ortho-Phenylendiamin (OPD) und 0,1 % Wasserstoffperoxid (H2O2) entwickelt, und die OD wird bei 492 nm gemessen. Eine 2-fache oder höhere Antikörperreaktion wird als signifikante Reaktion angesehen.

Transkriptomikanalyse: Von einer Untergruppe von erwachsenen Patienten und Impflingen werden 3 ml Blut in Tempus-RNA-Röhrchen (angewandtes Biosystem) entnommen und RNA wird aus dem Blut extrahiert, die Transkriptomsequenzierung wird in Shanghi, China (BGI), einem Dienstleistungsunternehmen, durchgeführt Labor und Daten werden mithilfe von RNA-Seq-Sequenzierung der nächsten Generation analysiert, um das Genexpressionsprofil zu sehen. Die differentielle Genexpression wird mit dem DESeq-Paket (Bioconductor) analysiert. Die erhaltenen Sequenz-Reads werden zwischen Patienten/Impflingen und gesunden Kontrollen normalisiert. Ein Verhältnis größer als 2 und kleiner als 0,5 wird als signifikant angesehen.