Cellulære immunresponser hos tyfuspatienter og -vaccinerede

Beskrivelse af forskningsprojektet: Det er tidligere vist, at IFN-gamma og IL-17 er forhøjet hos tyfuspatienter. Det blev vist, at S. Typhi-infektion inducerer antistofresponser mod en række nøgletyfus-antigener (LPS) HlyE, Flagellar-protein FliC og chaperonprotein EcpD). I den enteriske diarrésygdom kolera aktiveres MAIT-celler, og associerede LPS-specifikke antistofresponser genereres. I en human challenge model undersøgelse er det blevet vist, at CD8+ T-cellehukommelsesceller er nøglekorrelater for beskyttelse mod tyfus. Den levende svækkede tyfusvaccine (TY21a) inducerer også MAIT-celler efter immunisering. Det er blevet vist, at IL-12, IL-15, IL-18 inducerer hukommelseslignende NK-celler i en musemodel, og IL-21 inducerer hukommelseslignende NK-celler, der beskytter mod Mycobacterium tuberculosis-infektion. Rollen af ​​aktiverede MAIT-celler og cytokin-inducerede hukommelseslignende NK-celler i tyfus i øjeblikket ukendt.

En af de multiple drabsmekanismer, der anvendes af neutrofiler, er frigivelsen af ​​neutrofile ekstracellulære fælder (NET), der indeholder myeloperoxidase (MPO), elastase, lysozym og defensiner. Infektion inducerer frigivelse af NET'er for at fange mikrobielle patogener. Neutrofiler isoleret fra tyfuspatienter frigiver NET'er i, og den neutrofile NET-frigivelse primes ved vaccination med en subunit-konjugatvaccine.

Undersøgelsesintervention: Typbar-TCV er en Tyfus Vi kapsel polysaccharid tetanustoxoid konjugatvaccine. Typbar-TCV er verdens 1. klinisk dokumenterede konjugeret tyfusvaccine. Denne vaccine er WHO prækvalificeret og godkendt til børn og spædbørn under 2 år. I løbet af det kliniske fase III-studie fremkaldte en enkelt dosis Typbar-TCV 4 gange serokonversionsrater på 98,05 %, 99,17 % og 92,13 % hos forsøgspersoner mellem mere end 6 måneder til 2 år, >2 til 15 år og >15 til 45 år hhv. Hver frivillig i studiets vaccinationsarm vil modtage 25 ug Typbar-TCV-vaccine administreret som 0,5 ml enkelt intracellulær dosis.

Opbevaringsbetingelser: Vaccinen vil blive opbevaret ved +2-8C og kølekæden vil blive opretholdt til enhver tid.

Undersøgelsesdeltagere og prøveindsamling: Efterforskerne vil indsamle 8-10 ml blod fra voksne og 3-5 ml blod fra børn, der vil være mistænkte tyfuspatienter (1-59 år) ved indskrivning (dag 1), og hvis patienten er S. Typhi/Paratyphi kultur bekræftet, derefter vil der blive indsamlet yderligere to blodprøver (2-5 dage og 27-33 dage senere). Efterforskerne vil indsamle 8-10 ml blod fra voksne og 3-5 ml blod fra børn før vaccination (dag 0) og yderligere to blodprøver efter én dosis vaccination på dag 7 (6-8 dage senere) [13] og på dag 30 (27-33 dage senere). Perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) og neutrofiler vil blive isoleret fra blodprøver og vil blive brugt til forskellige assays (Polymorphprep kit). Plasmaprøver vil blive adskilt for at måle antistofrespons på infektion og vaccination.

Patientbehandling Afhængigt af klinikerens skøn vil patienten blive behandlet med antibiotika og andet nødvendigt lægemiddel. Efter dyrkning bekræftelse af tyfus antibiotikabehandling vil blive justeret afhængigt af antibiotika følsomhed mønster. Hvis patienten ikke reagerer på oralt antibiotikum, vil vi give injicerbart antibiotikum. Hvis patienten ikke reagerer på injicerbart antibiotika, og/eller der opstår andre komplikationer, vil patienten blive indlagt. Efterforskerne udfører endnu et tyfusundersøgelse, hvor patienterne er indskrevet på forskellige sundhedsfaciliteter i Mirpur og også icddr,b Dhaka hospital. Patientbehandlingen vil blive understøttet af andet igangværende tyfusprojekt.

Laboratorieanalyseprocedure:

MAIT- og NK-celleassay: Isolerede PBMC'er vil blive farvet med fluorochrom-mærkede antistoffer og flowcytometrisk fænotypning udført (erhvervelse af ≥50.000 levende celler på en FACS-Aria). MAIT-celler vil blive defineret som levende (DAPI-) CD3+CD4-CD161hiVα7.2+ celler, udtrykt som en procentdel af totale CD3+-lymfocytter, og CD38 anvendt som en markør for celleaktivering. Forskerne vil også vurdere hyppigheden af ​​cirkulerende levende CD3+CD8+CD4-CD161loVα7.2+ celler, som er blevet foreslået at være MAIT-afledte celler forbundet med fraværende eller reduceret cytokinsekretion in vitro. CD4+ (levende CD3+ CD8-CD4+) T-celleresponser hos forsøgspersoner vil blive evalueret i forskellige T-hukommelse (TM) undersæt defineret ved deres ekspression af CD45RA og CD62L, dvs. T central hukommelse (TCM; CD45RA-CD62L+), T effektor hukommelse ( TEM; CD45RA-CD62L-) og T-effektorhukommelse CD45RA+ (TEMRA; CD45RA+CD62L-), T-follikulære (CD3+CXCR5+) og Naive T-celler (TN: CD45RA+CD62L+). Aktiveret NK-celle som levende CD3-, CD45+, CD56+, CD69+, CD40L+, CD16+ celler og hukommelse som NK-celle som levende CD3-CD56+CD16+NKp46+CD27+.

Cytokinanalyse: Isolerede lymfocytter vil blive stimuleret med S. Typhi-antigener (Hele celle, MP og LPS) i 48 timer samt i 5 dage, og kultursupernatanten vil blive opsamlet og opbevaret indtil analyseret ved -70°C. Cytokiner i kultursupernatant vil blive analyseret ved hjælp af multiplex perlearray (Luminex).

Kvantificering af NET: Neutrofiler vil blive isoleret fra perifert blod baseret på tidligere beskrevet metode. Frigivelsen af ​​NET'er vil blive målt ved hjælp af neutrofil NET assay kit (NET assay kit, Creative Biomart, NY, USA). NETosis vil blive kvantificeret ved at måle niveauer af elastase, der frigives fra neutrofiler, og NET-medieret drab vil blive kvantificeret ved at måle bakteriers levedygtighed.

NETs medieret drabsassay: For at bestemme effektiviteten af ​​NETs til at dræbe S. Typhi, udføres en CFU-analyse. Natkultur S. Typhi vil blive co-inkuberet med frisk isolerede humane neutrofiler i 96-brønds kulturplade og inkuberet ved 37ºC. Efter 3 timers inkubation vil brøndene blive aspireret og vasket med PBS. Fortyndinger på 1:10 og 1:100 vil blive lavet, og 100 µl af hver fortynding vil blive udpladet på Brain Heart Infusion (BHI) agar. Kulturplader vil blive inkuberet ved 37ºC med 5% CO2. Antallet af CFU vil blive talt efter 24 timers inkubation og efter 3 dages dyrkning, indtil der ikke observeres yderligere stigning i koloniantal.

Neutrofil intracellulær metabolitassay: Neutrofiler vil blive isoleret fra blod og inkuberet ved 37ºC i 1 time til restitution. Inkubationsmediet aspireres, og 1 ml tøris (-80ºC) kold 80% methanol tilsættes. Celler vil blive vortexet i 1 min og derefter centrifugeret ved 15 K rpm i 1 min. Supernatanten vil blive opsamlet i rør og opbevaret ved -80ºC indtil brug. Før analyse fjernes prøver fra -80ºC og får lov til at ækvilibrere til stuetemperatur. Supernatanten (75 µl) vil blive overført til et væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS) hætteglas. Ti mikroliter prøve vil blive autoloaded i LC-MS-systemet til metabolitadskillelse og massespektrometrisk analyse.

Antistofreaktioner på lipopolysaccharid (LPS) i plasma. Plasmaantistofresponser på S. Typhi LPS hos patienter og vaccinerede vil blive målt ved hjælp af ELISA-metoder. Kort fortalt vil 96-brønds mikrotiterplader blive coatet med LPS og inkuberet med plasma (1:10 fortynding) med 3-folds seriefortyndinger derefter. Plader vil blive vasket, og peberrodsperoxidase-konjugeret anti-humant IgA, IgG og IgM antistoffer vil blive tilføjet. Plader vil blive udviklet ved hjælp af 0,1 % ortho-phenylendiamin (OPD) og 0,1 % hydrogenperoxid (H2O2), og OD vil blive målt ved 492 nm. Et 2 gange eller højere antistofrespons vil blive betragtet som et signifikant respons.

Transkriptomisk analyse: Fra en undergruppe af voksne patienter og vaccinerede vil 3 ml blod blive opsamlet i Tempus RNA-rør (anvendt biosystem), og RNA vil blive ekstraheret fra blod, transkriptomisk sekventering vil blive udført i Shanghi, Kina (BGI), som er en tjeneste, der leverer lab og data vil blive analyseret ved hjælp af næste generations RNA-seq-sekventering for at se genekspressionsprofilen. Differentiel genekspression vil blive analyseret ved hjælp af DESeq-pakken (Bioconductor). De opnåede sekvensaflæsninger vil blive normaliseret mellem patienter/vaccinerede versus raske kontroller. Et forhold større end 2 og lavere end 0,5 vil blive betragtet som signifikant.