Respostas imunes celulares em pacientes com febre tifóide e vacinados

Descrição do Projeto de Pesquisa: Foi previamente demonstrado que IFN-gama e IL-17 estão aumentados em pacientes com febre tifoide. Foi demonstrado que a infecção por S. Typhi induz respostas de anticorpos contra vários antígenos tifóides chave (LPS) HlyE, proteína flagelar FliC e proteína chaperon EcpD). Na cólera da doença diarreica entérica, as células MAIT são ativadas e são geradas respostas de anticorpos específicas de LPS associadas. Em um estudo de modelo de desafio humano, foi demonstrado que as células de memória de células T CD8+ são correlatas-chave de proteção contra a febre tifoide. A vacina viva atenuada contra a febre tifóide (TY21a) também induz células MAIT após a imunização. Foi demonstrado que IL-12, IL-15, IL-18 induzem células NK tipo memória em um modelo de camundongo e IL-21 induz células NK tipo memória protetoras contra infecção por Mycobacterium tuberculosis. O papel das células MAIT ativadas e das células NK tipo memória induzidas por citocinas na febre tifóide é atualmente desconhecido.

Um dos mecanismos de morte múltipla empregados pelos neutrófilos é a liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) que contêm mieloperoxidase (MPO), elastase, lisozima e defensinas. A infecção induz a liberação de NETs para capturar patógenos microbianos. Os neutrófilos isolados de pacientes com febre tifóide liberam NETs e essa liberação de NET de neutrófilos é iniciada pela vacinação com uma vacina conjugada de subunidade.

Intervenção do estudo: Typbar-TCV é uma vacina conjugada de polissacarídeo capsular tifóide Vi e toxóide tetânico. Typbar-TCV é a primeira vacina contra a febre tifóide clinicamente comprovada do mundo. Esta vacina é pré-qualificada pela OMS e aprovada para crianças e bebês com menos de 2 anos de idade. Durante o estudo clínico de Fase III, uma dose única de Typbar-TCV provocou taxas de soroconversão 4 vezes maiores de 98,05%, 99,17% e 92,13% em indivíduos entre mais de 6 meses a 2 anos, >2 a 15 anos e >15 a 45 anos respectivamente. Cada voluntário no braço de vacinação do estudo receberá 25 ug de vacina Typbar-TCV administrada como dose única intracelular de 0,5 ml.

Condições de armazenamento: A vacina será armazenada a +2-8°C e a cadeia de frio será mantida o tempo todo.

Participantes do estudo e coleta de amostras: Os investigadores irão coletar 8-10 ml de sangue de adultos e 3-5 ml de sangue de crianças que serão pacientes com suspeita de febre tifóide (idade 1-59 anos) no momento da inscrição (dia 1) e se o paciente for Cultura de S. Typhi/Paratyphi confirmada, então mais duas amostras de sangue (2-5 dias e 27-33 dias depois) serão coletadas. Os investigadores irão coletar 8-10 ml de sangue de adultos e 3-5 ml de sangue de crianças antes da vacinação (dia 0) e mais duas amostras de sangue após uma dose de vacinação no dia 7 (6-8 dias depois) [13] e no dia 30 (27-33 dias depois). Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) e neutrófilos serão isolados de amostras de sangue e serão utilizados para diferentes ensaios (kit Polymorphprep). Amostras de plasma serão separadas para medir a resposta de anticorpos à infecção e vacinação.

Manejo do paciente Dependendo do critério do médico, o tratamento do paciente com antibióticos e outros medicamentos necessários será fornecido. Após a confirmação da cultura da febre tifóide, o tratamento com antibióticos será ajustado dependendo do padrão de sensibilidade aos antibióticos. Se o paciente não responder ao antibiótico oral, forneceremos antibiótico injetável. Se o paciente permanecer sem resposta ao antibiótico injetável e/ou surgir outra complicação, o paciente será hospitalizado. Os investigadores estão conduzindo outro estudo de febre tifóide em que os pacientes estão matriculados em diferentes unidades de saúde em Mirpur e também no hospital icddr,b Dhaka. A gestão do paciente será apoiada por outro projeto tifóide em andamento.

Procedimento de Ensaio Laboratorial:

Ensaio MAIT e células NK: PBMCs isolados serão corados com anticorpos marcados com fluorocromo e fenotipagem por citometria de fluxo realizada (aquisição de ≥50000 células vivas em um FACS-Aria). As células MAIT serão definidas como vivas (DAPI-) CD3+CD4-CD161hiVα7.2+ células, expresso como uma porcentagem de linfócitos CD3+ totais, e CD38 usado como marcador de ativação celular. Os investigadores também avaliarão a frequência de células vivas CD3+CD8+CD4-CD161loVα7.2+ circulantes, que foram sugeridas como células derivadas de MAIT associadas à secreção ausente ou reduzida de citocinas in vitro. As respostas de células T CD4+ (CD3+ CD8-CD4+ vivas) nos sujeitos do estudo serão avaliadas em diferentes subconjuntos de memória T (TM) definidos por sua expressão de CD45RA e CD62L, ou seja, memória T central (TCM; CD45RA-CD62L+), memória T efetora ( TEM; CD45RA-CD62L-) e memória efetora T CD45RA+ (TEMRA; CD45RA+CD62L-), T folicular (CD3+CXCR5+) e células T virgens (TN: CD45RA+CD62L+). Células NK ativadas como células CD3-, CD45+, CD56+, CD69+, CD40L+, CD16+ vivas e memória como células NK como CD3-CD56+CD16+NKp46+CD27+ vivas.

Análise de citocinas: Os linfócitos isolados serão estimulados com antígenos de S. Typhi (Célula inteira, MP e LPS) por 48 horas e por 5 dias e o sobrenadante da cultura será coletado e armazenado até análise a -70°C. As citocinas no sobrenadante da cultura serão analisadas usando multiplex bead array (Luminex).

Quantificação de NETs: Os neutrófilos serão isolados do sangue periférico com base no método descrito anteriormente. A liberação de NETs será medida pelo kit de ensaio de NET de neutrófilos (NET assay kit, Creative Biomart, NY, EUA). A NETosis será quantificada medindo os níveis de elastase que são liberados dos neutrófilos e a morte mediada por NETs será quantificada medindo a viabilidade das bactérias.

Ensaio de morte mediada por NETs: Para determinar a eficiência de NETs em matar S. Typhi, será realizado um ensaio de CFU. A cultura noturna de S. Typhi será co-incubada com neutrófilos humanos recém-isolados em placa de cultura de 96 poços e incubada a 37ºC. Após 3 horas de incubação, os poços serão aspirados e lavados com PBS. Serão feitas diluições de 1:10 e 1:100 e 100 µl de cada diluição serão semeados em ágar Brain Heart Infusion (BHI). As placas de cultura serão incubadas a 37ºC com 5% de CO2. O número de UFC será contado após 24 horas de incubação e após 3 dias de cultivo até que não seja mais observado aumento no número de colônias.

Ensaio do metabólito intracelular de neutrófilos: Os neutrófilos serão isolados do sangue e incubados a 37ºC por 1 hora para recuperação. O meio de incubação será aspirado e adicionado 1 ml de gelo seco (-80ºC) metanol 80% frio. As células serão agitadas por 1 min e depois centrifugadas a 15 K rpm por 1 min. O sobrenadante será coletado em tubos e armazenado a -80ºC até o uso. Antes da análise, as amostras serão removidas de -80ºC e deixadas equilibrar à temperatura ambiente. O sobrenadante (75 µl) será transferido para um frasco de cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) tampado. Dez microlitros de amostra serão carregados automaticamente no sistema LC-MS para separação de metabólitos e análise por espectrometria de massa.

Respostas de anticorpos ao lipopolissacarídeo (LPS) no plasma. As respostas de anticorpos plasmáticos para S. Typhi LPS em pacientes e vacinados serão medidas usando métodos ELISA. Resumidamente, placas de microtitulação de 96 poços serão revestidas com LPS e incubadas com plasma (diluição 1:10) com diluições seriadas de 3 vezes a partir de então. As placas serão lavadas e adicionados anticorpos IgA, IgG e IgM anti-humanos conjugados com peroxidase de rábano. As placas serão reveladas com orto-fenileno diamina (OPD) 0,1% e peróxido de hidrogênio (H2O2) 0,1%, e a DO será medida em 492 nm. Uma resposta de anticorpos de 2 vezes ou mais será considerada uma resposta significativa.

Análise transcriptômica: De um subconjunto de pacientes adultos e vacinados, 3 ml de sangue serão coletados em tubos de RNA Tempus (biossistema aplicado) e o RNA será extraído do sangue, o sequenciamento transcriptômico será feito em Shanghi, China (BGI), que é um serviço prestador de o laboratório e os dados serão analisados ​​usando sequenciamento de RNA-seq de última geração para ver o perfil de expressão gênica. A expressão gênica diferencial será analisada usando o pacote DESeq (Bioconductor). As leituras de sequência obtidas serão normalizadas entre pacientes/vacinados versus controles saudáveis. Uma razão maior que 2 e menor que 0,5 será considerada significativa.