Celluláris immunreakciók tífuszos betegeknél és oltottaknál

A kutatási projekt leírása: Korábban kimutatták, hogy az IFN-gamma és az IL-17 emelkedett a tífuszos betegekben. Kimutatták, hogy az S. Typhi fertőzés számos kulcstífusz antigén (LPS) HlyE, Flagellar protein FliC és chaperon protein EcpD ellen indukál antitest választ. A kolera enterális hasmenéses betegségben a MAIT sejtek aktiválódnak, és kapcsolódó LPS-specifikus antitestválaszok keletkeznek. Egy humán kihívást jelentő modellvizsgálat során kimutatták, hogy a CD8+ T-sejt memóriasejtek a tífusz elleni védelem kulcsfontosságú összefüggései. Az élő, legyengített tífusz vakcina (TY21a) immunizálás után MAIT sejteket is indukál. Kimutatták, hogy az IL-12, IL-15, IL-18 egérmodellben memóriaszerű NK sejteket indukál, az IL-21 pedig memóriaszerű NK sejteket indukál, amelyek védelmet nyújtanak a Mycobacterium tuberculosis fertőzés ellen. Az aktivált MAIT sejtek és a citokin által indukált memóriaszerű NK sejtek szerepe tífuszban jelenleg nem ismert.

A neutrofilek által alkalmazott többszörös elpusztító mechanizmusok egyike a neutrofil extracelluláris csapdák (NET) felszabadulása, amelyek myeloperoxidázt (MPO), elasztázt, lizozimot és defenzineket tartalmaznak. A fertőzés NET-ek felszabadulását idézi elő a mikrobiális kórokozók csapdába ejtésére. A tífuszos betegekből izolált neutrofilek NET-et bocsátanak ki, és a neutrofil NET felszabadulását egy alegység-konjugált vakcinával történő vakcináció indítja el.

Vizsgálati beavatkozás: A Typbar-TCV egy tífusz Vi kapszuláris poliszacharid tetanusz toxoid konjugált vakcina. A Typbar-TCV a világ első klinikailag bizonyított konjugált tífusz vakcinája. Ez a vakcina WHO előzetes minősítéssel rendelkezik, és 2 évesnél fiatalabb gyermekek és csecsemők számára engedélyezett. A III. fázisú klinikai vizsgálat során a Typbar-TCV egyszeri adagja 4-szeres szerokonverziós arányt váltott ki, 98,05%, 99,17% és 92,13% a 6 hónapnál 2 évnél idősebb, 2 és 15 év közötti és 15 és 45 év közötti egyéneknél. év, ill. A vizsgálat vakcinázási csoportjában minden önkéntes 25 ug Typbar-TCV vakcinát kap 0,5 ml-es egyszeri intracelluláris dózisban.

Tárolási feltételek: Az oltóanyagot +2-8 C-on tároljuk és a hűtőláncot folyamatosan fenntartjuk.

A vizsgálatban résztvevők és mintavétel: A vizsgálatot végzők 8-10 ml vért vesznek fel felnőttektől és 3-5 ml vért gyermekektől, akik tífuszos betegek (1-59 éves korig) a beiratkozáskor (1. nap), és ha a beteg S. Typhi/Paratyphi tenyésztés megerősített, majd további két vérmintát veszünk (2-5 nappal és 27-33 nappal később). A kutatók 8-10 ml vért gyűjtenek a felnőttektől és 3-5 ml vért a gyermekektől az oltás előtt (0. nap), és további két vérmintát egy adag oltás után a 7. napon (6-8 nappal később) [13] és a 30. napon (27-33 nappal később). A perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) és a neutrofileket a vérmintákból izolálják, és különböző vizsgálatokhoz használják (Polymorphprep kit). A plazmamintákat szétválasztják a fertőzésre és a vakcinázásra adott antitestválasz mérésére.

Betegkezelés A klinikus belátása szerint a beteg antibiotikumos és egyéb szükséges gyógyszeres kezelését biztosítják. A tífusz tenyésztése után az antibiotikum kezelést az antibiotikum érzékenységi mintázattól függően módosítják. Ha a beteg nem reagál az orális antibiotikumra, akkor injekciós antibiotikumot biztosítunk. Ha a beteg nem reagál az injekciós antibiotikumra és/vagy egyéb szövődmény lép fel, akkor a beteget kórházba kell szállítani. A nyomozók egy másik tífusz-vizsgálatot végeznek, ahol a betegeket Mirpur különböző egészségügyi intézményeibe íratják be, valamint az icddr,b dakkai kórházba. A betegellátást egy másik folyamatban lévő tífusz projekt is támogatja.

Laboratóriumi vizsgálati eljárás:

MAIT- és NK-sejt-vizsgálat: Az izolált PBMC-ket fluorokrómmal jelölt antitestekkel festik meg, és áramlási citometriás fenotipizálást végeznek (≥50000 élő sejt gyűjtése FACS-Aria-n). A MAIT sejteket élő (DAPI-) CD3+CD4-CD161hiVα7.2+-ként határozzuk meg. sejtek, az összes CD3+ limfociták százalékában kifejezve, és a sejtaktiváció markereként használt CD38. A kutatók felmérik a keringő élő CD3+CD8+CD4-CD161loVα7.2+ sejtek gyakoriságát is, amelyekről azt feltételezték, hogy MAIT-eredetű sejtek, amelyek in vitro hiányzó vagy csökkent citokinszekrécióval társulnak. A CD4+ (élő CD3+ CD8-CD4+) T-sejtes válaszokat a vizsgálati alanyokban különböző T-memória (TM) részhalmazokban értékeljük, amelyeket a CD45RA és CD62L expressziója határoz meg, azaz a T-központi memória (TCM; CD45RA-CD62L+), a T-effektor memória ( TEM; CD45RA-CD62L-) és T effektor memória CD45RA+ (TEMRA; CD45RA+CD62L-), T follikuláris (CD3+CXCR5+) és naiv T-sejtek (TN: CD45RA+CD62L+). Az aktivált NK sejt élő CD3-, CD45+, CD56+, CD69+, CD40L+, CD16+ sejtekként és a memória, mint az NK sejt, mint élő CD3-CD56+CD16+NKp46+CD27+.

Citokin analízis: Az izolált limfocitákat S. Typhi antigénekkel (teljes sejt, MP és LPS) stimuláljuk 48 órán keresztül, valamint 5 napig, és a tenyészet felülúszóját összegyűjtjük, és az elemzésig -70 °C-on tároljuk. A tenyészet felülúszójában lévő citokineket multiplex gyöngysor (Luminex) alkalmazásával elemezzük.

A NET-ek mennyiségi meghatározása: A neutrofileket a perifériás vérből izoláljuk a korábban leírt módszer alapján. A NET-ek felszabadulását a neutrofil NET vizsgálati készlettel (NET assay kit, Creative Biomart, NY, USA) mérjük. A NETózist a neutrofilekből felszabaduló elasztáz szintjének mérésével, a NET-ek által közvetített pusztulást pedig a baktériumok életképességének mérésével fogják számszerűsíteni.

NET-ek által közvetített ölési vizsgálat: A NET-ek S. Typhi elpusztításában való hatékonyságának meghatározására CFU-vizsgálatot kell végezni. Egy éjszakán át tartó tenyészet S. Typhi-t frissen izolált humán neutrofilekkel együtt inkubáljuk 96 lyukú tenyésztőlemezen, és 37 °C-on inkubáljuk. 3 órás inkubáció után a lyukakat leszívjuk és PBS-sel mossuk. 1:10 és 1:100 hígításokat készítünk, és mindegyik hígításból 100 µl-t Brain Heart Infusion (BHI) agarra szélesztünk. A tenyésztő lemezeket 37 °C-on 5% CO2-val inkubáljuk. A CFU számát 24 órás inkubáció és 3 napos tenyésztés után számoljuk meg, amíg a telepszám további növekedését nem észleljük.

Neutrophil intracelluláris metabolit vizsgálat: A neutrofileket izoláljuk a vérből, és 37 °C-on 1 órán át inkubáljuk a helyreállításhoz. Az inkubációs táptalajt leszívjuk, és 1 ml szárazjeget (-80 °C), hideg 80%-os metanolt adunk hozzá. A sejteket 1 percig vortexeljük, majd 15 K rpm-en 1 percig centrifugáljuk. A felülúszót csövekbe gyűjtik, és felhasználásig -80 °C-on tárolják. Az elemzés előtt a mintákat -80 ºC-ról eltávolítjuk, és hagyjuk szobahőmérsékletre kiegyenlítődni. A felülúszót (75 µl) egy lezárt folyadékkromatográfiás-tandem tömegspektrometriás (LC-MS) fiolába visszük át. Tíz mikroliter mintát automatikusan betöltenek az LC-MS rendszerbe metabolitok elválasztásához és tömegspektrometriás elemzéshez.

Antitest válaszok lipopoliszacharidra (LPS) a plazmában. Az S. Typhi LPS-re adott plazma antitest válaszokat a betegekben és a vakcinázottakban ELISA módszerekkel mérjük. Röviden, a 96 lyukú mikrotiterlemezeket LPS-sel vonjuk be, majd plazmával (1:10 hígítás) inkubáljuk háromszoros hígítási sorozattal. A lemezeket lemossák, és torma-peroxidázzal konjugált anti-humán IgA, IgG és IgM antitesteket adnak hozzá. A lemezeket 0,1% orto-fenilén-diamin (OPD) és 0,1% hidrogén-peroxid (H2O2) felhasználásával fejlesztik ki, és az OD-t 492 nm-en mérik. A kétszeres vagy magasabb antitestválasz szignifikáns válasznak minősül.

Transzkriptomikai analízis: Felnőtt betegek és beoltottak egy részéből 3 ml vért gyűjtenek Tempus RNS csövekbe (alkalmazott biorendszer), és RNS-t vonnak ki a vérből, transzkriptomikus szekvenálást a kínai Shanghiban (BGI) végeznek, amely egy szolgáltatást nyújt. Laboratóriumot és az adatokat next-gen RNS-seq szekvenálás segítségével elemezzük a génexpressziós profil megtekintéséhez. A differenciális génexpressziót a DESeq csomag (Bioconductor) segítségével elemezzük. A kapott szekvencia-leolvasott értékeket normalizálják a betegek/vakcináltak és az egészséges kontrollok között. A 2-nél nagyobb és 0,5-nél kisebb arány szignifikánsnak minősül.