Respuestas inmunes celulares en pacientes con fiebre tifoidea y vacunados

Descripción del Proyecto de Investigación: Previamente se ha demostrado que el IFN-gamma y la IL-17 están aumentados en pacientes con fiebre tifoidea. Se demostró que la infección por S. Typhi induce respuestas de anticuerpos contra una serie de antígenos tifoideos clave (LPS) HlyE, proteína flagelar FliC y proteína chaperona EcpD). En la enfermedad diarreica entérica del cólera, las células MAIT se activan y se generan respuestas de anticuerpos específicas de LPS asociadas. En un estudio de modelo de desafío humano, se demostró que las células de memoria de células T CD8+ son correlatos clave de protección contra la fiebre tifoidea. La vacuna tifoidea viva atenuada (TY21a) también induce células MAIT después de la inmunización. Se ha demostrado que IL-12, IL-15, IL-18 inducen células NK de memoria en un modelo de ratón e IL-21 induce células NK de memoria protectoras contra la infección por Mycobacterium tuberculosis. Actualmente se desconoce el papel de las células MAIT activadas y las células NK similares a la memoria inducidas por citoquinas en la fiebre tifoidea.

Uno de los múltiples mecanismos de destrucción empleados por los neutrófilos es la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) que contienen mieloperoxidasa (MPO), elastasa, lisozima y defensinas. La infección induce la liberación de NET para atrapar patógenos microbianos. Los neutrófilos aislados de pacientes con fiebre tifoidea liberan NET y esa liberación de NET de neutrófilos se estimula mediante la vacunación con una vacuna conjugada de subunidades.

Intervención del estudio: Typbar-TCV es una vacuna conjugada de toxoide tetánico de polisacárido capsular contra la fiebre tifoidea Vi. Typbar-TCV es la primera vacuna contra la fiebre tifoidea conjugada clínicamente probada del mundo. Esta vacuna está precalificada y aprobada por la OMS para niños y bebés menores de 2 años. Durante el estudio clínico de Fase III, una dosis única de Typbar-TCV provocó tasas de seroconversión de 4 veces del 98,05 %, 99,17 % y 92,13 % en sujetos de más de 6 meses a 2 años, de >2 a 15 años y de >15 a 45 años. años respectivamente. Cada voluntario en el brazo de vacunación del estudio recibirá 25 ug de la vacuna Typbar-TCV administrada como una dosis intracelular única de 0,5 ml.

Condiciones de almacenamiento: La vacuna se almacenará a +2-8C y se mantendrá la cadena de frío en todo momento.

Participantes del estudio y recolección de muestras: los investigadores recolectarán de 8 a 10 ml de sangre de adultos y de 3 a 5 ml de sangre de niños que serán pacientes sospechosos de fiebre tifoidea (de 1 a 59 años de edad) en el momento de la inscripción (día 1) y si el paciente es El cultivo de S. Typhi/Paratyphi confirmó que luego se recolectarán dos muestras de sangre más (2 a 5 días y 27 a 33 días después). Los investigadores recolectarán 8-10 ml de sangre de adultos y 3-5 ml de sangre de niños antes de la vacunación (día 0) y dos muestras de sangre más después de una dosis de vacunación en el día 7 (6-8 días después) [13] y al día 30 (27-33 días después). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y los neutrófilos se aislarán de muestras de sangre y se utilizarán para diferentes ensayos (kit Polymorphprep). Las muestras de plasma se separarán para medir la respuesta de anticuerpos a la infección y la vacunación.

Manejo del paciente Según el criterio del médico, se proporcionará tratamiento al paciente con antibióticos y otros medicamentos necesarios. Después de la confirmación del cultivo de fiebre tifoidea, el tratamiento con antibióticos se ajustará según el patrón de sensibilidad a los antibióticos. Si el paciente no responde al antibiótico oral, le proporcionaremos un antibiótico inyectable. Si el paciente no responde al antibiótico inyectable y/o surgen otras complicaciones, el paciente será hospitalizado. Los investigadores están realizando otro estudio sobre la fiebre tifoidea en el que los pacientes están inscritos en diferentes centros de atención médica en Mirpur y también en el hospital icddr,b de Dhaka. El manejo del paciente será apoyado por otro proyecto de fiebre tifoidea en curso.

Procedimiento de ensayo de laboratorio:

Ensayo de células MAIT y NK: las PBMC aisladas se tiñerán con anticuerpos marcados con fluorocromo y se realizará el fenotipado de citometría de flujo (adquisición de ≥50 000 células vivas en un FACS-Aria). Las células MAIT se definirán como vivas (DAPI-) CD3+CD4-CD161hiVα7.2+ células, expresadas como porcentaje del total de linfocitos CD3+, y CD38 utilizado como marcador de activación celular. Los investigadores también evaluarán la frecuencia de circulación de células vivas CD3+CD8+CD4-CD161loVα7.2+, que se ha sugerido que son células derivadas de MAIT asociadas con una secreción de citoquinas ausente o reducida in vitro. Las respuestas de células T CD4+ (CD3+ CD8-CD4+ vivos) en los sujetos del estudio se evaluarán en diferentes subconjuntos de memoria T (TM) definidos por su expresión de CD45RA y CD62L, es decir, memoria central T (TCM; CD45RA-CD62L+), memoria efectora T ( TEM; CD45RA-CD62L-) y T efector memoria CD45RA+ (TEMRA; CD45RA+CD62L-), T folicular (CD3+CXCR5+) y células T naïve (TN: CD45RA+CD62L+). Células NK activadas como células CD3-, CD45+, CD56+, CD69+, CD40L+, CD16+ vivas y memoria como células NK como CD3-CD56+CD16+NKp46+CD27+ vivas.

Análisis de citocinas: los linfocitos aislados se estimularán con antígenos de S. Typhi (células enteras, MP y LPS) durante 48 horas y durante 5 días y el sobrenadante del cultivo se recolectará y almacenará hasta su análisis a -70 °C. Las citocinas en el sobrenadante del cultivo se analizarán mediante el uso de una matriz de microesferas multiplex (Luminex).

Cuantificación de NET: los neutrófilos se aislarán de la sangre periférica según el método descrito anteriormente. La liberación de NET se medirá con el kit de ensayo NET de neutrófilos (kit de ensayo NET, Creative Biomart, NY, EE. UU.). La NETosis se cuantificará midiendo los niveles de elastasa que se liberan de los neutrófilos y la muerte mediada por NET se cuantificará midiendo la viabilidad de las bacterias.

Ensayo de destrucción mediado por NET: Para determinar la eficacia de los NET en la eliminación de S. Typhi, se realizará un ensayo de CFU. El cultivo nocturno de S. Typhi se coincubará con neutrófilos humanos recién aislados en una placa de cultivo de 96 pocillos y se incubará a 37 ºC. Después de 3 horas de incubación, los pocillos se aspirarán y lavarán con PBS. Se realizarán diluciones de 1:10 y 1:100 y se sembrarán 100 µl de cada dilución en agar Brain Heart Infusion (BHI). Las placas de cultivo se incubarán a 37ºC con 5% de CO2. El número de UFC se contará después de 24 horas de incubación y después de 3 días de cultivo hasta que no se observe un aumento adicional en el número de colonias.

Ensayo de metabolitos intracelulares de neutrófilos: los neutrófilos se aislarán de la sangre y se incubarán a 37 ºC durante 1 hora para su recuperación. Se aspirarán los medios de incubación y se añadirá 1 ml de hielo seco (-80ºC) metanol al 80% frío. Las células se agitarán durante 1 min y luego se centrifugarán a 15 K rpm durante 1 min. El sobrenadante se recogerá en tubos y se almacenará a -80ºC hasta su uso. Antes del análisis, las muestras se retirarán de -80ºC y se dejarán equilibrar a temperatura ambiente. El sobrenadante (75 µl) se transferirá a un vial de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS) tapado. Se cargarán automáticamente diez microlitros de muestra en el sistema LC-MS para la separación de metabolitos y el análisis espectrométrico de masas.

Respuestas de anticuerpos al lipopolisacárido (LPS) en plasma. Las respuestas de anticuerpos plasmáticos a S. Typhi LPS en pacientes y vacunados se medirán mediante métodos ELISA. Brevemente, las placas de microtitulación de 96 pocillos se recubrirán con LPS y se incubarán con plasma (dilución 1:10) con diluciones en serie de 3 veces a partir de entonces. Se lavarán las placas y se añadirán anticuerpos IgA, IgG e IgM antihumanos conjugados con peroxidasa de rábano picante. Las placas se revelarán utilizando ortofenilendiamina (OPD) al 0,1 % y peróxido de hidrógeno (H2O2) al 0,1 %, y la DO se medirá a 492 nm. Una respuesta de anticuerpos doble o superior se considerará una respuesta significativa.

Análisis transcriptómico: de un subconjunto de pacientes adultos y vacunados, se recolectarán 3 ml de sangre en tubos Tempus RNA (biosistema aplicado) y el ARN se extraerá de la sangre, la secuencia transcriptómica se realizará en Shanghi, China (BGI), que es un servicio que brinda el laboratorio y los datos se analizarán mediante secuenciación de ARN-seq de próxima generación para ver el perfil de expresión génica. La expresión génica diferencial se analizará utilizando el paquete DESeq (Bioconductor). Las lecturas de secuencias obtenidas se normalizarán entre pacientes/vacunados frente a controles sanos. Se considerará significativo un cociente superior a 2 e inferior a 0,5.