Risposte immunitarie cellulari in pazienti con febbre tifoide e vaccinati

Descrizione del Progetto di Ricerca: E' stato precedentemente dimostrato che IFN-gamma e IL-17 sono aumentati nei pazienti con febbre tifoide. È stato dimostrato che l'infezione da S. Typhi induce risposte anticorpali contro un numero di antigeni tifoidi chiave (LPS) HlyE, proteina flagellare FliC e proteina chaperon EcpD). Nel colera della malattia diarroica enterica, le cellule MAIT vengono attivate e vengono generate risposte anticorpali specifiche LPS associate. In uno studio su un modello di sfida umana, è stato dimostrato che le cellule di memoria delle cellule T CD8+ sono correlate chiave della protezione contro la febbre tifoide. Anche il vaccino tifoide vivo attenuato (TY21a) induce le cellule MAIT dopo l'immunizzazione. È stato dimostrato che IL-12, IL-15, IL-18 inducono cellule NK simili alla memoria in un modello murino e IL-21 induce cellule NK simili alla memoria protettive contro l'infezione da Mycobacterium tuberculosis. Il ruolo delle cellule MAIT attivate e delle cellule NK simili alla memoria indotte da citochine nella febbre tifoide è attualmente sconosciuto.

Uno dei meccanismi di uccisione multipla impiegati dai neutrofili è il rilascio di trappole extracellulari dei neutrofili (NET) che contengono mieloperossidasi (MPO), elastasi, lisozima e defensine. L'infezione induce il rilascio di NET per intrappolare i patogeni microbici. I neutrofili isolati da pazienti con febbre tifoide rilasciano NET e il rilascio di NET di neutrofili è innescato dalla vaccinazione con un vaccino coniugato a subunità.

Intervento di studio: Typbar-TCV è un vaccino coniugato tossoide tetanico polisaccaridico capsulare tifoide Vi. Typbar-TCV è il primo vaccino contro il tifo coniugato clinicamente testato al mondo. Questo vaccino è prequalificato dall'OMS e approvato per bambini e lattanti di età inferiore a 2 anni. Durante lo studio clinico di fase III, una singola dose di Typbar-TCV ha suscitato tassi di sieroconversione quadruplicati del 98,05%, 99,17% e 92,13% in soggetti di età compresa tra più di 6 mesi e 2 anni, tra >2 e 15 anni e tra >15 e 45 anni. anni rispettivamente. Ogni volontario nel braccio vaccinale dello studio riceverà 25 ug di vaccino Typbar-TCV somministrato come singola dose intracellulare da 0,5 ml.

Condizioni di conservazione: il vaccino sarà conservato a +2-8C e la catena del freddo sarà sempre mantenuta.

Partecipanti allo studio e raccolta del campione: gli investigatori raccoglieranno 8-10 ml di sangue da adulti e 3-5 ml di sangue da bambini che saranno sospettati di febbre tifoide (età 1-59 anni) al momento dell'arruolamento (giorno 1) e se il paziente è La coltura di S. Typhi/Paratyphi sarà confermata, quindi verranno raccolti altri due campioni di sangue (2-5 giorni e 27-33 giorni dopo). Gli investigatori raccoglieranno 8-10 ml di sangue da adulti e 3-5 ml di sangue da bambini prima della vaccinazione (giorno 0) e altri due campioni di sangue dopo una dose di vaccinazione al giorno 7 (6-8 giorni dopo) [13] e al giorno 30 (27-33 giorni dopo). Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) ei neutrofili saranno isolati dai campioni di sangue e saranno utilizzati per diversi saggi (Kit Polymorphprep). I campioni di plasma saranno separati per misurare la risposta anticorpale all'infezione e alla vaccinazione.

Gestione del paziente A discrezione del medico, sarà fornito il trattamento del paziente con antibiotici e altri farmaci necessari. Dopo la conferma colturale della febbre tifoide, il trattamento antibiotico verrà regolato in base al modello di sensibilità agli antibiotici. Se il paziente non risponde all'antibiotico orale, forniremo antibiotico iniettabile. Se il paziente rimane senza risposta all'antibiotico iniettabile e/o sorgono altre complicazioni, il paziente verrà ricoverato in ospedale. Gli investigatori stanno conducendo un altro studio sul tifo in cui i pazienti sono arruolati in diverse strutture sanitarie a Mirpur e anche all'icddr,b Dhaka hospital. La gestione del paziente sarà supportata da altri progetti di tifo in corso.

Procedura di analisi di laboratorio:

MAIT e analisi delle cellule NK: le PBMC isolate saranno colorate con anticorpi marcati con fluorocromo ed eseguita la fenotipizzazione citometrica a flusso (acquisizione di ≥50000 cellule vive su un FACS-Aria). Le cellule MAIT saranno definite come live (DAPI-) CD3+CD4-CD161hiVα7.2+ cellule, espresso come percentuale dei linfociti CD3+ totali, e CD38 utilizzato come marcatore di attivazione cellulare. Gli investigatori valuteranno anche la frequenza delle cellule CD3+CD8+CD4-CD161loVα7.2+ vive in circolazione, che è stato suggerito essere cellule derivate da MAIT associate a secrezione di citochine assente o ridotta in vitro. Le risposte delle cellule T CD4+ (CD3+ CD8-CD4+ live) nei soggetti dello studio saranno valutate in diversi sottoinsiemi di memoria T (TM) definiti dalla loro espressione di CD45RA e CD62L, ovvero memoria centrale T (TCM; CD45RA-CD62L+), memoria T effettrice ( TEM; CD45RA-CD62L-) e T effettrici della memoria CD45RA+ (TEMRA; CD45RA+CD62L-), T follicolari (CD3+CXCR5+) e cellule T naïve (TN: CD45RA+CD62L+). Cellule NK attivate come cellule CD3-, CD45+, CD56+, CD69+, CD40L+, CD16+ vive e memoria come cellule NK come cellule CD3-CD56+CD16+NKp46+CD27+ vive.

Analisi delle citochine: I linfociti isolati saranno stimolati con antigeni di S. Typhi (Whole cell, MP e LPS) per 48 ore e per 5 giorni e il surnatante di coltura sarà raccolto e conservato fino all'analisi a -70°C. Le citochine nel surnatante di coltura saranno analizzate utilizzando multiplex bead array (Luminex).

Quantificazione dei NET: I neutrofili saranno isolati dal sangue periferico sulla base del metodo precedentemente descritto. Il rilascio di NET sarà misurato mediante kit di analisi dei NET dei neutrofili (Kit di analisi NET, Creative Biomart, NY, USA). La NETosis sarà quantificata misurando i livelli di elastasi rilasciati dai neutrofili e l'uccisione mediata dai NET sarà quantificata misurando la vitalità dei batteri.

Test di uccisione mediata da NET: per determinare l'efficienza dei NET nell'uccisione di S. Typhi, verrà eseguito un test di CFU. La coltura notturna di S. Typhi sarà co-incubata con neutrofili umani appena isolati in una piastra di coltura a 96 pozzetti e incubata a 37ºC. Dopo 3 ore di incubazione, i pozzetti saranno aspirati e lavati con PBS. Saranno effettuate diluizioni di 1:10 e 1:100 e 100 µl di ciascuna diluizione saranno seminati su agar Brain Heart Infusion (BHI). Le piastre di coltura saranno incubate a 37ºC con il 5% di CO2. Il numero di UFC verrà contato dopo 24 ore di incubazione e dopo 3 giorni di coltura fino a quando non si osserverà un ulteriore aumento del numero di colonie.

Saggio del metabolita intracellulare dei neutrofili: I neutrofili saranno isolati dal sangue e incubati a 37ºC per 1 ora per il recupero. Il mezzo di incubazione verrà aspirato e verrà aggiunto 1 ml di ghiaccio secco (-80ºC) freddo all'80% di metanolo. Le cellule saranno vortexate per 1 min, e poi centrifugate a 15 K rpm per 1 min. Il surnatante sarà raccolto in provette e conservato a -80ºC fino al momento dell'uso. Prima dell'analisi i campioni saranno rimossi da -80ºC e lasciati equilibrare a temperatura ambiente. Il supernatante (75 µl) sarà trasferito in una fiala per cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS) chiusa. Dieci microlitri di campione verranno caricati automaticamente nel sistema LC-MS per la separazione dei metaboliti e l'analisi spettrometrica di massa.

Risposte anticorpali al lipopolisaccaride (LPS) nel plasma. Le risposte anticorpali plasmatiche a S. Typhi LPS nei pazienti e nei vaccinati saranno misurate utilizzando metodi ELISA. In breve, le piastre per microtitolazione a 96 pozzetti saranno rivestite con LPS e incubate con plasma (diluizione 1:10) con successive diluizioni seriali di 3 volte. Le piastre saranno lavate e verranno aggiunti anticorpi IgA, IgG e IgM anti-umani coniugati con perossidasi di rafano. Le piastre saranno sviluppate usando lo 0.1% di orto-fenilendiammina (OPD) e lo 0.1% di perossido di idrogeno (H2O2), e la OD sarà misurata a 492 nm. Una risposta anticorpale doppia o superiore sarà considerata una risposta significativa.

Analisi trascrittomica: da un sottogruppo di pazienti adulti e vaccinati verranno raccolti 3 ml di sangue in provette Tempus RNA (biosistema applicato) e l'RNA verrà estratto dal sangue, il sequenziamento trancriptomico verrà eseguito a Shanghi, Cina (BGI), che è un servizio che fornisce il laboratorio e i dati saranno analizzati utilizzando il sequenziamento di RNA-seq di nuova generazione per vedere il profilo di espressione genica. L'espressione genica differenziale sarà analizzata utilizzando il pacchetto DESeq (Bioconductor). Le letture della sequenza ottenute saranno normalizzate tra pazienti/vaccini rispetto a controlli sani. Un rapporto maggiore di 2 e minore di 0,5 sarà considerato significativo.