Buněčné imunitní odpovědi u pacientů s horečkou tyfu a očkovaných

Popis výzkumného projektu: Již dříve bylo prokázáno, že IFN-gama a IL-17 jsou zvýšené u pacientů s břišním tyfem. Bylo prokázáno, že infekce S. Typhi indukuje protilátkové reakce proti řadě klíčových tyfových antigenů (LPS) HlyE, bičíkovému proteinu FliC a chaperonovému proteinu EcpD). Při enterickém průjmovém onemocnění cholera jsou MAIT buňky aktivovány a jsou generovány související LPS specifické protilátkové odpovědi. Ve studii lidského provokačního modelu se ukázalo, že paměťové buňky CD8+ T buněk jsou klíčovými koreláty ochrany proti břišnímu tyfu. Živá atenuovaná vakcína proti tyfu (TY21a) také indukuje buňky MAIT po imunizaci. Bylo ukázáno, že IL-12, IL-15, IL-18 indukují paměťové NK buňky v myším modelu a IL-21 indukuje paměťové NK buňky, které jsou chráněny proti infekci Mycobacterium tuberculosis. Role aktivovaných MAIT buněk a cytokinem indukovaných paměťových NK buněk u tyfu v současnosti není známa.

Jedním z vícenásobných mechanismů zabíjení neutrofilů je uvolnění neutrofilních extracelulárních pastí (NET), které obsahují myeloperoxidázu (MPO), elastázu, lysozym a defensiny. Infekce indukuje uvolňování NET k zachycení mikrobiálních patogenů. Neutrofily izolované od pacientů s břišním tyfem uvolňují NET a toto uvolňování neutrofilů NET je aktivováno vakcinací podjednotkovou konjugovanou vakcínou.

Intervence studie: Typbar-TCV je kapsulární polysacharidová vakcína s konjugátem tetanového toxoidu tyfu Vi. Typbar-TCV je 1. klinicky ověřená konjugovaná vakcína proti tyfu na světě. Tato vakcína je předem kvalifikovaná a schválená WHO pro děti a kojence mladší 2 let. Během klinické studie fáze III vyvolala jedna dávka Typbar-TCV 4násobnou míru sérokonverze 98,05 %, 99,17 % a 92,13 % u subjektů ve věku od 6 měsíců do 2 let, od 2 do 15 let a od 15 do 45 let. let resp. Každý dobrovolník v očkovací větvi studie dostane 25 ug vakcíny Typbar-TCV podané jako 0,5 ml jediné intracelulární dávky.

Podmínky skladování: Vakcína bude skladována při +2-8C a po celou dobu bude zachován chladící řetězec.

Účastníci studie a odběr vzorků: Vyšetřovatelé odeberou 8–10 ml krve od dospělých a 3–5 ml krve od dětí, u kterých bude podezření na břišní tyfus (ve věku 1–59 let) při zařazení (den 1) a pokud je pacient Kultura S. Typhi/Paratyphi potvrzena, poté budou odebrány další dva vzorky krve (2-5 dní a 27-33 dní později). Vyšetřovatelé odeberou 8-10 ml krve od dospělých a 3-5 ml krve od dětí před očkováním (den 0) a další dva vzorky krve po jedné dávce očkování v den 7 (6-8 dní později) [13] a v den 30 (27-33 dní později). Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) a neutrofily budou izolovány ze vzorků krve a budou použity pro různé testy (souprava Polymorphprep). Vzorky plazmy budou separovány pro měření protilátkové odpovědi na infekci a vakcinaci.

Léčba pacienta Dle uvážení lékaře bude zajištěna léčba pacienta antibiotiky a dalšími potřebnými léky. Po kultivačním potvrzení břišního tyfu bude antibiotická léčba upravena v závislosti na vzoru citlivosti na antibiotika. Pokud pacient nereaguje na perorální antibiotika, poskytneme mu injekční antibiotika. Pokud pacient nereaguje na injekční antibiotikum a/nebo se objeví jiná komplikace, bude pacient hospitalizován. Vyšetřovatelé provádějí další studii tyfu, kde jsou pacienti zařazeni do různých zdravotnických zařízení v Mirpur a také v nemocnici icddr,b Dhaka. Léčba pacientů bude podpořena dalším probíhajícím projektem proti tyfu.

Postup laboratorního testu:

Test MAIT a NK buněk: Izolované PBMC se obarví protilátkami značenými fluorochromem a provede se fenotypizace průtokovou cytometrií (získání ≥50 000 živých buněk na FACS-Aria). Buňky MAIT budou definovány jako živé (DAPI-) CD3+CD4-CD161hiVα7.2+ buňky, vyjádřené jako procento celkových CD3+ lymfocytů, a CD38 použitý jako marker buněčné aktivace. Výzkumníci budou také hodnotit frekvenci cirkulujících živých CD3+CD8+CD4-CD161loVα7.2+ buněk, o kterých se předpokládá, že jsou to buňky odvozené od MAIT asociované s nepřítomnou nebo sníženou sekrecí cytokinů in vitro. CD4+ (živé CD3+ CD8-CD4+) reakce T buněk u studovaných subjektů budou hodnoceny v různých podskupinách T paměti (TM) definovaných jejich expresí CD45RA a CD62L, tj. T centrální paměti (TCM; CD45RA-CD62L+), T efektorové paměti ( TEM; CD45RA-CD62L-) a T efektorová paměť CD45RA+ (TEMRA; CD45RA+CD62L-), T folikulární (CD3+CXCR5+) a naivní T buňky (TN: CD45RA+CD62L+). Aktivované NK buňky jako živé CD3-, CD45+, CD56+, CD69+, CD40L+, CD16+ buňky a paměťové jako NK buňky jako živé CD3-CD56+CD16+NKp46+CD27+.

Analýza cytokinů: Izolované lymfocyty budou stimulovány antigeny S. Typhi (celé buňky, MP a LPS) po dobu 48 hodin a také po dobu 5 dnů a supernatant kultury bude odebrán a skladován až do analýzy při -70 °C. Cytokiny v kultivačním supernatantu budou analyzovány pomocí multiplexního kuličkového pole (Luminex).

Kvantifikace NET: Neutrofily budou izolovány z periferní krve na základě dříve popsané metody. Uvolňování NET bude měřeno soupravou pro stanovení neutrofilů NET (sada pro stanovení NET, Creative Biomart, NY, USA). NETóza bude kvantifikována měřením hladin elastázy, která se uvolňuje z neutrofilů a zabíjení zprostředkované NETs bude kvantifikováno měřením životaschopnosti bakterií.

Test zabíjení zprostředkovaného NETs: Pro stanovení účinnosti NETs při zabíjení S. Typhi bude proveden test CFU. Kultivace S. Typhi přes noc bude koinkubována s čerstvě izolovanými lidskými neutrofily v 96-jamkové kultivační destičce a inkubována při 37ºC. Po 3 hodinách inkubace se jamky odsají a promyjí PBS. Připraví se ředění 1:10 a 1:100 a 100 µl každého ředění se nanese na agar Brain Heart Infusion (BHI). Kultivační destičky budou inkubovány při 37ºC s 5% CO2. Počet CFU bude počítán po 24 hodinách inkubace a po 3 dnech kultivace, dokud není pozorován žádný další nárůst počtu kolonií.

Test intracelulárního metabolitu neutrofilů: Neutrofily budou izolovány z krve a inkubovány při 37ºC po dobu 1 hodiny pro obnovu. Inkubační médium se odsaje a přidá se 1 ml suchého ledu (-80ºC) studeného 80% methanolu. Buňky budou vortexovány po dobu 1 minuty a poté centrifugovány při 15 K rpm po dobu 1 minuty. Supernatant bude shromážděn ve zkumavkách a skladován při -80ºC až do použití. Před analýzou se vzorky odeberou z -80ºC a nechají se vyrovnat na pokojovou teplotu. Supernatant (75 ul) se přenese do lahvičky s kapalinovou chromatografií a tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS) uzavřené víčkem. Deset mikrolitrů vzorku bude automaticky vloženo do systému LC-MS pro separaci metabolitů a hmotnostní spektrometrickou analýzu.

Protilátkové odpovědi na lipopolysacharid (LPS) v plazmě. Plazmatické protilátkové odpovědi na S. Typhi LPS u pacientů a očkovaných budou měřeny pomocí metod ELISA. Stručně, 96jamkové mikrotitrační destičky budou potaženy LPS a inkubovány s plazmou (ředění 1:10) s následným sériovým 3násobným ředěním. Destičky se promyjí a přidají se protilátky proti lidskému IgA, IgG a IgM konjugované s křenovou peroxidázou. Destičky budou vyvinuty s použitím 0,1% ortho-fenylendiaminu (OPD) a 0,1% peroxidu vodíku (H2O2) a OD bude měřena při 492 nm. Dvojnásobná nebo vyšší protilátková odpověď bude považována za významnou odpověď.

Transkriptomická analýza: Od podskupiny dospělých pacientů a očkovaných budou odebrány 3 ml krve do zkumavek Tempus RNA (aplikovaný biosystém) a RNA bude extrahována z krve, transkriptomické sekvenování bude provedeno v Shanghi, Čína (BGI), což je služba poskytující laboratoř a data budou analyzována pomocí sekvenování RNA-seq příští generace, aby se viděl profil genové exprese. Diferenciální genová exprese bude analyzována pomocí balíčku DESeq (Bioconductor). Získané odečty sekvencí budou normalizovány mezi pacienty/vakcíny oproti zdravým kontrolám. Poměr větší než 2 a nižší než 0,5 bude považován za významný.