前立腺の経尿道的切除からの生検を用いた尿路上皮組織工学 (IMOPU)

生検の組織学的分析。

標準着色による組織学的分析は、尿路上皮の生存率を評価します。 壊死の徴候（潰瘍、尿路上皮構造の破壊）が認められる。

生検の免疫組織学的分析。

特異的抗体を用いた免疫組織学的分析は、尿路上皮 (ケラチン、ウロプラキン)、平滑筋 (平滑筋アクチン)、前立腺 (前立腺特異抗原) を特定します。

生検のRT-qPCR分析。

RT-qPCR 分析では、尿路上皮 (ケラチン、ウロプラキン)、平滑筋 (平滑筋アクチン)、前立腺 (前立腺特異抗原) に特異的な RNA の発現レベル (ハウスキーピング遺伝子 RPLP0 と比較) を測定します。 このレベルは培養尿路上皮細胞と比較されます。

生検の消化と適応培地による培養。培養条件の最適化。

生検は、ディスパーゼを使用して消化されます。 細胞は、コラーゲンコーティングされた支持体に播種され、ケラチノサイト無血清培地（KSFM）を使用して培養されます。 合流点でトリプシン処理を行う。

RT-qPCR (各特定のマーカーの発現レベル) は、培養中の進化を評価するために各継代で実現されます。

培養細胞の組織学的分析。

培養細胞 (結果 4) は、対照位相顕微鏡法および標準的な顕微鏡着色法で分析され、その形態、細胞型の数、および継代中の進化が評価されます。

培養細胞の免疫細胞学的分析。

培養細胞 (結果 4) は免疫細胞学で分析され、細胞の種類 (尿路上皮/平滑筋/前立腺)、特定のマーカーの発現と局在 (結果 2) が評価されます。

培養細胞のRT-qPCR分析。

培養細胞 (結果 4) は、各継代で RT-qPCR で分析され、培養中の進化を評価します。 尿路上皮（ケラチン、ウロプラキン）、平滑筋（平滑筋アクチン）、前立腺（前立腺特異抗原）に特異的なRNAの発現レベル（ハウスキーピング遺伝子RPLP0と比較）を測定します。

独自のアルギン酸凍結乾燥足場の開発

アルギン酸ナトリウムハイドロゲルをベースに独自の足場を開発し、凍結乾燥して多孔性スポンジを生成します（-20°Cおよび-80°C）。

構造解析、不浸透性、縫合性…

培養細胞と異なる足場との結合。細胞化足場の培養。

以前に培養および分析された細胞は、異なる足場に関連付けられます。

• コラーゲン足場

• アルジネート足場

  • スプレーによって得られるアルギン酸ヒドロゲル
  • 元のアルギン酸凍結乾燥足場 (結果 4) 細胞化された足場は、前述の条件を使用して少なくとも 28 日間培養されます。

細胞化足場の組織学的分析

関連付けの後、細胞化された足場 (結果 9) は、少なくとも 28 日間培養されます。

MTTアッセイを使用した生存率が実行されます。 細胞化された足場の外観、位置、細胞の外観および組織を評価するために、標準的な着色を使用した組織学的分析が行われる。

細胞化足場の免疫組織学的分析

関連付けの後、細胞化された足場 (結果 9) は、少なくとも 28 日間培養されます。

特定のマーカーの発現と位置を評価するために、免疫組織学的分析が行われます (結果 2)

細胞化された足場の RT-qPCR 分析

関連付けの後、細胞化された足場 (結果 9) は、少なくとも 28 日間培養されます。

RT-qPCR は、3 次元条件での培養中の進化を評価するために実行されます。 尿路上皮（ケラチン、ウロプラキン）、平滑筋（平滑筋アクチン）、前立腺（前立腺特異抗原）に特異的なRNAの発現レベル（ハウスキーピング遺伝子RPLP0と比較）を測定します。

細胞化足場の生物物理学的解析

関連付けの後、細胞化された足場 (結果 9) は、少なくとも 28 日間培養されます。

細胞化された足場の生物物理学的分析が行われます。

• 経上皮電気抵抗（不浸透性バリアを形成する細胞の能力）
• 不透過性（細胞化された足場が耐水性バリアを形成する能力）
• 縫い合わせる能力（細胞化された足場を操作して縫い合わせる能力）
• 尿に対する耐性（細胞化された足場が尿の化学的攻撃に抵抗する能力）

ヌードマウスへの細胞化足場の移植

細胞化された足場は、ヌードマウスの皮下に移植されます。 in vivo でのインキュベーションは、少なくとも 28 日間行われます。 分析 (組織学、免疫組織学、RT-qPCR) は、28 日間のインキュベーション後に実行され、in vivo での細胞の生存と細胞化された足場の挙動を評価します。 壊死、血管新生および炎症の徴候が認められる。

移植された足場の組織学的分析

組織学的分析は、細胞化された足場の外観、位置、細胞の外観および組織を評価するために、移植された足場での28日間のインキュベーション後に行われます（結果14）。

MTTアッセイを使用した生存率が実行されます。 線維症の徴候が認められる。

移植された足場の免疫組織学的分析

組織学的分析は、移植された足場での28日間のインキュベーション後に実行され（結果14）、評価されます 免疫組織学的分析は、特定のマーカーの発現と位置を評価するために実行されます（結果2）

移植された足場の RT-qPCR 分析

RT-qPCR 分析は、移植された足場 (結果 14) での 28 日間のインキュベーション後に実行され、in vivo 条件での進化を評価します。 尿路上皮（ケラチン、ウロプラキン）、平滑筋（平滑筋アクチン）、前立腺（前立腺特異抗原）に特異的なRNAの発現レベル（ハウスキーピング遺伝子RPLP0と比較）を測定します。