Urothelium Tissue Engineering med hjälp av biopsier från transuretral resektion av prostata (IMOPU)

Histologisk analys av biopsi.

Histologisk analys med standardfärgning kommer att bedöma viabiliteten av urotel. Tecken på nekros (sårbildning, förstörelse av urotelets struktur) kommer att noteras.

Immunhistologisk analys av biopsi.

Immunohistologisk analys med användning av specifika antikroppar kommer att lokalisera urothelium (Keratin, Uroplakin), den glatta muskulaturen (Smooth muscle actin), prostatakörteln (Prostatic specific antigen).

RT-qPCR-analys av biopsi.

RT-qPCR-analys kommer att mäta uttrycksnivån (jämfört med hushållsgenen RPLP0) av RNA specifikt för urotel (Keratin, Uroplakin), glatt muskulatur (Smooth muscle actin), prostatakörteln (Prostataspecifikt antigen). Denna nivå kommer att jämföras med odlade urotelceller.

Digestion av biopsi och odling med anpassat medium. Optimering av odlingsförhållanden.

Biopsien kommer att smältas med dispase. Celler kommer att sås på kollagenbelagda underlag och odlas med Keratinocyte Serum Free Medium (KSFM). Trypsinering kommer att göras vid sammanflödet.

RT-qPCR (uttrycksnivå för varje specifik markör) kommer att realiseras vid varje passage för att bedöma utvecklingen under odlingen.

Histologisk analys av de odlade cellerna.

Odlade celler (Utfall 4) kommer att analyseras i kontrastfasmikroskopi och med standardmikroskopifärgning för att bedöma deras morfologi, antalet celltyper och deras utveckling genom passagerna.

Immunocytologisk analys av de odlade cellerna.

Odlade celler (Utfall 4) kommer att analyseras i immunocytologi för att bedöma typen av celler (urotelial / glatt muskulatur / prostata), uttrycket och lokaliseringen av specifika markörer (Utfall 2)

RT-qPCR-analys av de odlade cellerna.

Odlade celler (Utfall 4) kommer att analyseras i RT-qPCR vid varje passage för att bedöma utvecklingen under odlingen. Uttrycksnivån (jämfört med hushållsgenen RPLP0) av RNA som är specifik för urotel (Keratin, Uroplakin), den glatta muskeln (Smooth muscle actin), prostatakörteln (Prostatic specific antigen) kommer att mätas.

Utveckling av original alginat frystorkad ställning

Utveckling av en original ställning baserad på natriumalginathydrogeler, följt av frystorkning för att generera porösa svampar (vid -20°C och -80°C).

Analys av struktur, ogenomtränglighet, förmåga att sys..

Förening av de odlade cellerna med olika byggnadsställningar. Kultur av cellulariserade ställningar.

Tidigare odlade och analyserade celler kommer att kopplas till olika byggnadsställningar.

• Kollagen ställningar

• Alginatställningar

  • Alginathydrogeler erhållna genom spray
  • Original alginat frystorkad ställning (Resultat 4) Cellulariserade ställningar kommer att odlas i minst 28 dagar med tidigare beskrivna förhållanden.

Histologisk analys av cellulariserade ställningar

Efter association kommer cellulariserade ställningar (Utfall 9) att odlas i minst 28 dagar.

Överlevnadshastighet med MTT-analys kommer att utföras. Histologisk analys med användning av standardfärgningar kommer att utföras för att utvärdera utseendet på den cellulariserade ställningen, platsen, utseendet och organiseringen av cellerna.

Immunhistologisk analys av cellulariserade byggnadsställningar

Efter association kommer cellulariserade ställningar (Utfall 9) att odlas i minst 28 dagar.

Immunhistologisk analys kommer att utföras för att utvärdera uttrycket och placeringen av specifika markörer (Utfall 2)

RT-qPCR-analys av cellulariserade byggnadsställningar

Efter association kommer cellulariserade ställningar (Utfall 9) att odlas i minst 28 dagar.

RT-qPCR kommer att utföras för att bedöma utvecklingen under odling i 3-dimensionella förhållanden. Uttrycksnivån (jämfört med hushållsgenen RPLP0) av RNA som är specifik för urotel (Keratin, Uroplakin), den glatta muskeln (Smooth muscle actin), prostatakörteln (Prostatic specific antigen) kommer att mätas.

Biofysisk analys av cellulariserade ställningar

Efter association kommer cellulariserade ställningar (Utfall 9) att odlas i minst 28 dagar.

Biofysisk analys på cellulariserade byggnadsställningar kommer att göras:

• Transepitelialt elektriskt motstånd (cellulär förmåga att bilda en ogenomtränglig barriär)
• Ogenomtränglighet (förmåga hos den cellulära ställningen att bilda en vattentät barriär)
• Förmåga att sys (förmågan hos den cellulariserade ställningen att manipuleras och sys)
• Resistens mot urin (förmåga hos den cellulariserade ställningen att motstå kemisk aggression av urin)

Implantation av den cellulariserade ställningen i nakna möss

Cellulariserade ställningar kommer att implanteras på subkutan plats i nakna möss. Inkubation in vivo kommer att göras under minst 28 dagar. Analys (histologi, immunhistologi, RT-qPCR) kommer att utföras efter 28 dagars inkubation för att bedöma överlevnaden av celler och beteendet hos den cellulariserade ställningen in vivo. Tecken på nekros, neoangiogenes och inflammation kommer att noteras.

Histologisk analys av implanterade ställningar

Histologisk analys kommer att utföras efter 28 dagars inkubation på implanterade ställningar (Utfall 14) för att utvärdera utseendet på den cellulariserade ställningen, platsen, utseendet och organiseringen av cellerna.

Överlevnadshastighet med MTT-analys kommer att utföras. Tecken på fibros kommer att noteras.

Immunhistologisk analys av implanterade ställningar

Histologisk analys kommer att utföras efter 28 dagars inkubation på implanterade byggnadsställningar (Utfall 14) för att utvärdera Immunohistologisk analys kommer att utföras för att utvärdera uttrycket och placeringen av specifika markörer (Utfall 2)

RT-qPCR-analys av implanterade ställningar

RT-qPCR-analys kommer att utföras efter 28 dagars inkubation på implanterade byggnadsställningar (Utfall 14) för att bedöma utvecklingen under in vivo-förhållanden. Uttrycksnivån (jämfört med hushållsgenen RPLP0) av RNA som är specifik för urotel (Keratin, Uroplakin), den glatta muskeln (Smooth muscle actin), prostatakörteln (Prostatic specific antigen) kommer att mätas.