肝硬変における肝細胞癌の予防におけるプロバイオティクス

研究課題プロバイオティクスによる腸内微生物叢の調節は、肝硬変患者の肝細胞癌の発症を予防しますか? この研究の目的は、門脈圧亢進症を伴うChild Pugh A-B肝硬変患者の肝細胞癌の発生率を低下させるプロバイオティクスの有効性を評価することです。

方法 研究デザイン。 第 III 相介入、多施設、無作為化、二重盲検、プラセボ対照試験。

次の研究は、CONSORT ガイドラインに従って実施されます。 シナリオと一時性。 この研究は、2019 年 4 月 1 日 (12 か月の募集段階) から最後の登録患者が無作為化から 3 年間の追跡調査を完了するまで、次の包含および除外基準を持つ患者ケアセンターを含むアルゼンチンで開発されます。

介入。 試験薬。 プロバイオティクスとプラセボは同じ容器、形、色で提供されます。

活性物質の名前 各 50 ml ボトルには、ラクトバチルス カゼイ 3.3 x 107 CFU / 日、ラクトバチルス プランタラム 3.3 x 107 CFU / 日、ストレプトコッカス フェカリス 3.3 x 107 CFU / 日、ビフィドバクテリウム ブレビス 1.0 x 106 CFU / 日 (BIOFLORA®、BIOSIDUS) が含まれています。南アフリカ、アルゼンチン) .

投与方法: 経口 5 ml を 12 時間ごとに 1 か月に 10 日間連続して経口投与。 治療期間: 3 年間、1 年に 2 サイクルの連続治療 (6 サイクル)。 各サイクルには 3 か月の治療が含まれ、その後 3 か月のオフ期間が続きます。

参照介入。 有効成分名：プラセボ。 投与方法: 経口 5 ml を 12 時間ごとに 1 か月に 10 日間連続して経口投与。 治療期間: 3 年間、1 年に 2 サイクルの連続治療 (6 サイクル)。 各サイクルには 3 か月の治療が含まれ、その後 3 か月のオフ期間が続きます。

**同様に、両方のアームは、すべての患者の研究を通じて、アルコールの非消費と非高カロリー地中海食の消費を明示的に要求します。

方法論。 前述の包含および除外基準を満たし、すべてのスクリーニング検査を正常に完了した患者は、1:1 の無作為化スキームを通じて、臨床診療ガイドラインに従って標準検査または治療薬で治療されます。

無作為化は、以前に特定された予後変数に従ってブロックで層別化され、潜在的な交絡変数を回避するため、および/またはバランスの取れていない方法で偶然に分布する修飾子に影響を与える: Child PughスコアBおよび血小板数<100,000/mm3。 無作為化は、臨床的特徴および患者との接触から独立して、盲検化された研究者によって以前に作成された番号による割り当てに従って実行されます。 ランダム化のすべての番号は、閉じた不透明な封筒に保存され、プロトコルに含まれる順序に従って連続して割り当てられます。

*研究を通じて発生したすべてのイベントは、一次および二次の両方で、ベースライン変数と無作為化割り当てから、盲検化された独立した委員会によって評価されます。 臨床事象は、3人の研究者で構成されるこの委員会によって監視および再評価されます。

露出変数。

• 臨床データ

• サイトカイン、LPS、および TLR 4 の発現を測定するための末梢血サンプル。

  • サイトカイン: サイトカインの測定は、末梢血サンプルの血漿から行われます。 次のサイトカインのレベルは pg/ml で定量化されます: IL-6、TNF-α、エンドトキシン血症または細菌性リポ多糖 (LPS)。 この測定のオペレーターは、臨床、マイクロバイオーム、および治療の割り当てについて知らされません。 各個人から採取するサンプル: 全血の 10 ml チューブ 2 本。1 本は EDTA (エチレンジアミン四酢酸ナトリウム) を含み、もう 1 本は抗凝固剤なしで、通常の実験室での研究およびサイトカイン (IL6 および TNF α) およびエンドトキシンの測定に使用されます ( LPS)。 血漿サイトカインの定量化：酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）の市販試薬を使用して、患者の血漿中に存在するサイトカインのレベルを測定します。 ＴＮＦαおよびＩＬ－６の濃度は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの市販試薬、または市場で入手可能な同様の市販試薬を用いて、それぞれの製造業者の指示に厳密に従って測定する。 サイトカインの定量化のために、曲線は対応する濃度基準で作成されます。
  • 血漿または血清中のエンドトキシンの定量化: バクテリア LPS の測定は、Limulus Amebocyte Lysate Assay (LAL)、Biosafe Srl 発色エンドポイント試薬、または標準の濃度曲線と並行して実行されます。 メーカーの指示に従います。
  • 末梢血単核細胞におけるＴＬＲ４の発現：単核細胞におけるＴＬＲ４の発現は、特異的プライマーを使用するリアルタイムＰＣＲ技術によって定量化される。

  • 腸内微生物叢評価のための便サンプル。

    1. 採取方法: 自然便のサンプルは、トイレ/無臭物質との接触を避けて、付属のマニホールドで 1 日のいつでも採取されます。 サンプルが収集されると、適切にキャップされたコレクターが安全バッグの内側とキット ボックスの内側に配置されます。 これらのサンプルは、-70º で凍結保存されます。 各糞便サンプルには適切にラベルを付ける必要があります。 その後、サンプルは最終処理のために分注されます。
    2. 分析: ロザリオの生物工学研究所 (INDEAR、ロザリオ、アルゼンチン) で 16sRNA の V3-V4 領域を分析する PCR 技術 Ilumina を使用して、腸内微生物叢を分析するために糞便が収集されます。 rRNA の 16S リボソーム サブユニットを細菌で分析し、PCR 法を使用して増幅し (20 サイクル)、次にマルチプレックス アダプター (バーコード) を組み込むための 2 回目の増幅を行います (10 サイクル)。 各手順では、増幅情報の偏りを避けるために 2 つの測定が行われます。 大規模なシーケンスは、HERITAS 研究所 (CIBIC + INDEAR) の illumina MiSeq チームで 2x300 モードで実行され、最終的に 1 人あたり最低 40,000 シーケンスが取得されます。 生データの品質は FastQC によって評価され、イルミナのペアエンドの情報は PEAR (v0.9.10) を使用して結合されます。 次に、読み取り値は Q30 品質によってフィルター処理され、重複と PCR キメラは UCHIME を使用して除去されます。 フィルター処理されたシーケンスは、QIIME (v1.91) で実装された独自の戦略と 97% の類似性で運用分類単位 (OTU) にクラスター化されます。 この測定のオペレーターは、臨床、マイクロバイオーム、および主要なイベント変数を認識しません。
• 次の測定は、登録された各被験者で、研究の終了または一次イベントの発生まで6か月ごとに実行されます：体重と身長、併用薬、完全な身体検査、臨床検査、チャイルドピュースコア、腹部超音波。
• 腸内微生物叢とサイトカインの縦断的サンプリング。 2回目のサイトカイン測定は、最初の治療サイクルの終わり（無作為化から3か月目または12週間）および研究の終わりに、研究に含まれるすべての患者の糞便サンプル中の末梢血および腸マイクロバイオームサンプルからの血清から行われます。 （最後のサイクル）上記と同じ方法を使用します。

アドヒアランスとフォローアップ：すべての患者は、3年間の無作為化後のフォローアップを完了して、主要なイベントが発生するまで、またはイベントが終了するまでプロトコルを継続します。 フォローアップの損失を避けるために、両方のアームと戦略の治療への遵守を強化するために、いくつかの対策が実施されます。 治療コンプライアンスの順守は、両方のアームに提供される錠剤の 80% で定義されます。

サンプルサイズの計算と統計分析: 両側の統計値が取得され、α またはタイプ I エラーは 5% (p 値 <0.05) で、検出力またはエラー タイプ II または β は 0.20 (検出力 80%) です。 ハザード比（HR）と95％信頼区間を使用したCox回帰分析を使用して、各アームのHCCのリスクを比較し、治療意図の原則に従って、臨床転帰を防ぐために治療に必要な数を計算します。 . 文献からの以前のデータからの HCC の累積発生率は 1 年あたり 1 ～ 6% であるため、介入群における 3 年間の HCC 発症の相対リスク減少は、30% の相対差で臨床的に関連すると推定されました。 0.7 の HR に相当します。 各アームについて、140 人の被験者のサンプルサイズ、280 人の患者を登録する総人口で、28 の主要なイベントの数を推定しました。

すべての統計分析は、STATA バージョン 14.0 を使用して実行されます。

マイクロバイオーム メタデータの分析。 データのバイオインフォマティクス分析は、カスタマイズされた QIIME パイプラインを使用して行われます。 グループ間の差分存在量の推定には、DESeq2 パッケージを使用します。