Probiotyki w profilaktyce raka wątrobowokomórkowego w marskości wątroby

Pytanie badawcze Czy modulacja mikrobiomu jelitowego probiotykami zapobiega rozwojowi raka wątrobowokomórkowego u pacjentów z marskością wątroby? Celem pracy jest ocena skuteczności probiotyków w zmniejszaniu częstości występowania raka wątrobowokomórkowego u pacjentów z marskością wątroby w skali Childa-Pugha i nadciśnieniem wrotnym.

Metody Projekt badania. Interwencyjne, wieloośrodkowe, randomizowane badanie III fazy z podwójnie ślepą próbą i kontrolą placebo.

Poniższe badanie zostanie przeprowadzone zgodnie z wytycznymi CONSORT. Scenariusz i czasowość. Badanie zostanie opracowane w Argentynie, w tym w ośrodkach opieki nad pacjentem, z następującymi kryteriami włączenia i wyłączenia, od 1 kwietnia 2019 r. (etap rekrutacji trwający 12 miesięcy) do czasu, gdy ostatni włączony pacjent zakończy 3-letnią obserwację od randomizacji.

Interwencja. Badany lek(i). Zarówno probiotyk, jak i placebo będą prezentowane w tym samym pojemniku, kształcie i kolorze.

Nazwa substancji czynnej Każda butelka 50 ml zawiera Lactobacillus casei 3,3 x 107 CFU/dzień, Lactobacillus plantarum 3,3 x 107 CFU/dzień, Streptococcus faecalis 3,3 x 107 CFU/dzień i Bifidobacterium brevis 1,0 x 106 CFU/dzień (BIOFLORA®, BIOSIDUS SA, Argentyna).

Sposób podawania: Doustnie 5 ml doustnie co 12 godzin przez 10 kolejnych dni w miesiącu. Czas trwania leczenia: 2 cykle leczenia ciągłego rocznie w okresie 3 lat (6 cykli). Każdy cykl obejmuje trzy miesiące leczenia, po których następuje trzymiesięczny okres przerwy.

Interwencja referencyjna. Nazwa substancji czynnej: Placebo. Sposób podawania: Doustnie 5 ml doustnie co 12 godzin przez 10 kolejnych dni w miesiącu. Czas trwania leczenia: 2 cykle leczenia ciągłego rocznie w okresie 3 lat (6 cykli). Każdy cykl obejmuje trzy miesiące leczenia, po których następuje trzymiesięczny okres przerwy.

**Podobnie obie grupy wyraźnie zażądają niespożywania alkoholu i spożywania niehiperkalorycznej diety śródziemnomorskiej przez cały okres badania dla wszystkich pacjentów.

Metodologia. Pacjenci, którzy spełniają wyżej wymienione kryteria włączenia i wyłączenia oraz pomyślnie przeszli wszystkie testy przesiewowe, będą leczeni standardowym lekiem testowym lub leczniczym zgodnie z wytycznymi praktyki klinicznej w ramach schematu randomizacji 1: 1.

Randomizacja będzie podzielona na bloki zgodnie z wcześniej zidentyfikowanymi zmiennymi prognostycznymi oraz w celu uniknięcia potencjalnych zmiennych zakłócających i/lub modyfikatorów efektu rozłożonych przypadkowo w niezrównoważony sposób: punktacja B w skali Childa-Pugha i liczba płytek krwi <100 000/mm3. Randomizacja zostanie przeprowadzona zgodnie z przydziałem za pomocą liczb wykonanych wcześniej przez zaślepionego badacza i niezależnie od charakterystyki klinicznej i kontaktu z pacjentami. Wszystkie numery randomizacji będą przechowywane w zamkniętych nieprzejrzystych kopertach i będą nadawane kolejno zgodnie z kolejnością włączenia do protokołu.

*Wszystkie opracowane zdarzenia, zarówno pierwotne, jak i wtórne w trakcie badania, zostaną ocenione przez zaślepioną i niezależną komisję na podstawie zmiennych wyjściowych i alokacji randomizacji. Zdarzenia kliniczne będą monitorowane i ponownie oceniane przez tę komisję, która będzie składać się z 3 badaczy.

Zmienne ekspozycji.

• Dane kliniczne

• Próbki krwi obwodowej do pomiaru cytokin, LPS i ekspresji TLR 4.

  • Cytokiny: Pomiar cytokin zostanie wykonany z próbek osocza krwi obwodowej. Poziomy następujących cytokin będą oznaczane ilościowo w pg/ml: IL-6, TNF-α oraz endotoksemia lub lipopolisacharyd bakteryjny (LPS). Operatorzy tego pomiaru będą ślepi na jakiekolwiek przydziały kliniczne, mikrobiom i leczenie. Próbki, które należy pobrać od każdej osoby: dwie 10 ml probówki pełnej krwi, jedna z EDTA (etylenodiaminotetraoctanem sodu), a druga bez antykoagulantu, do wykorzystania w rutynowych badaniach laboratoryjnych i pomiarach cytokin (IL6 i TNF alfa) oraz endotoksyn ( LPS). Oznaczanie ilościowe cytokin w osoczu: Komercyjne odczynniki do testu immunoenzymatycznego (ELISA) zostaną użyte do pomiaru poziomów cytokin obecnych w osoczu pacjentów. Stężenia TNF alfa i IL-6 będą mierzone za pomocą komercyjnych odczynników eBioscience, affymetrix lub podobnych komercyjnych odczynników dostępnych na rynku, ściśle według instrukcji odpowiednich producentów. W celu ilościowego oznaczenia cytokin, krzywe zostaną sporządzone z odpowiednimi standardami stężeń.
  • Oznaczanie ilościowe endotoksyn w osoczu lub surowicy: Pomiar bakteryjnego LPS zostanie przeprowadzony za pomocą testu Limulus Amebocyte Lysate Assay (LAL), odczynnika chromogennego Biosafe Srl lub podobnego, równolegle z krzywą stężeń wzorców. Instrukcje producenta będą przestrzegane.
  • Ekspresja TLR 4 w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej: ekspresja TLR 4 w komórkach jednojądrzastych będzie oznaczana ilościowo techniką PCR w czasie rzeczywistym, przy użyciu specyficznych starterów.

  • Próbki kału do oceny mikrobiomu jelitowego.

    1. Metoda pobierania: Próbka spontanicznego kału zostanie pobrana o dowolnej porze dnia do dostarczonego kolektora, unikając kontaktu z materiałami toaletowymi/bezzapachowymi. Po pobraniu próbki odpowiednio zamknięty kolektor zostanie umieszczony w torbie bezpieczeństwa i w pudełku z zestawem. Próbki te będą przechowywane zamrożone w temperaturze -70º. Każda próbka kału musi być odpowiednio oznakowana. Później próbki zostaną podzielone na porcje do ostatecznego przetworzenia.
    2. Analiza: Stolce kałowe zostaną zebrane w celu analizy mikrobiomu jelitowego przy użyciu techniki PCR, Ilumina, analizując regiony V3-V4 16sRNA w Instytucie Biotechnologii w Rosario (INDEAR, Rosario, Argentyna). Podjednostka rybosomalna 16S rRNA będzie analizowana bakteryjnie, amplifikowana metodą PCR (20 cykli), a następnie druga runda amplifikacji w celu włączenia adapterów multipleksowych (kody kreskowe) (10 cykli). W każdej procedurze zostaną wykonane dwa pomiary, aby uniknąć błędów informacyjnych dotyczących amplifikacji. Masowe sekwencjonowanie zostanie przeprowadzone przez zespół illumina MiSeq z instytutu HERITAS (CIBIC + INDEAR) w trybie 2x300, aby ostatecznie uzyskać minimum 40 000 sekwencji na osobę. Jakość surowych danych zostanie oceniona przez FastQC, a informacje o końcówkach par Illumina zostaną połączone za pomocą PEAR (v0.9.10). Odczyty są następnie filtrowane przez jakość Q30, a duplikaty i chimery PCR są eliminowane przy użyciu UCHIME. Filtrowane sekwencje zostaną zgrupowane w Operacyjne Jednostki Taksonomiczne (OTU) z 97% podobieństwem do ich własnej strategii zaimplementowanej w QIIME (v1.91). Operatorzy tego pomiaru będą ślepi na zmienne kliniczne, mikrobiom i zdarzenia pierwotne.
• Następujące pomiary będą wykonywane co 6 miesięcy u każdego uczestnika włączonego do badania lub wystąpienia zdarzenia głównego: masa ciała i wzrost, leki towarzyszące, pełne badanie przedmiotowe, testy laboratoryjne, wynik w skali Child-Pugh, USG jamy brzusznej.
• Podłużne pobieranie próbek mikrobiomu jelitowego i cytokin. Drugi pomiar cytokin zostanie wykonany z surowicy z krwi obwodowej i próbek mikrobiomu jelitowego w próbkach kału u wszystkich pacjentów włączonych do badania pod koniec pierwszego cyklu leczenia (3. miesiąc od randomizacji lub 12 tygodni) i na koniec badania (ostatni cykl) stosując tę ​​samą metodologię opisaną powyżej.

Przestrzeganie zaleceń i obserwacja: Wszyscy pacjenci będą kontynuowani w protokole do czasu wystąpienia zdarzenia głównego lub do jego zakończenia, po zakończeniu 3-letniej obserwacji po randomizacji. Przeprowadzonych zostanie kilka działań w celu wzmocnienia przestrzegania zaleceń terapeutycznych w obu ramionach oraz strategii mających na celu uniknięcie utraty obserwacji. Przestrzeganie zaleceń dotyczących leczenia zostanie określone w przypadku 80% tabletek dostarczonych dla obu ramion.

Obliczanie wielkości próby i analiza statystyczna: Zostanie przyjęta dwustronna wartość statystyczna, błąd α lub błąd typu I wynoszący 5% (wartość p <0,05) oraz moc lub błąd typu II lub β wynoszący 0,20 (moc 80%). Ryzyko HCC w każdej grupie zostanie porównane przy użyciu analizy regresji Coxa ze współczynnikami ryzyka (HR) i 95% przedziałami ufności, a liczba pacjentów potrzebnych do leczenia, aby zapobiec skutkom klinicznym, zostanie obliczona zgodnie z zasadą zamiaru leczenia . Ponieważ skumulowana częstość występowania HCC na podstawie wcześniejszych danych z piśmiennictwa wynosi 1-6% rocznie, oszacowano, że względne zmniejszenie ryzyka rozwoju HCC w okresie 3 lat w grupie objętej interwencją było istotne klinicznie z 30% względną różnicą, odpowiada HR 0,7. Dla każdego ramienia, wielkość próby 140 pacjentów, z całkowitą populacją do zapisania 280 pacjentów, szacowana liczba pierwotnych zdarzeń u 28.

Wszystkie analizy statystyczne zostaną przeprowadzone przy użyciu STATA w wersji 14.0.

Analiza metadanych mikrobiomu. Analiza bioinformatyczna danych zostanie przeprowadzona przy użyciu dostosowanego potoku QIIME. Do oszacowania zróżnicowanej obfitości między grupami używamy pakietu DESeq2.