Probiotika i forebygging av hepatocellulært karsinom ved cirrhosis

Forskningsspørsmål Forhindrer modulering av tarmmikrobiom med probiotika utvikling av hepatocellulært karsinom hos pasienter med cirrhose? Målet med denne studien er å evaluere effektiviteten av probiotika for å redusere forekomsten av hepatocellulært karsinom hos pasienter med Child Pugh A-B cirrhose med portal hypertensjon.

Metoder Studiedesign. Fase III intervensjonell, multisenter, randomisert, dobbeltblind, placebokontrollert studie.

Følgende studie vil bli utført i henhold til CONSORTs retningslinjer. Scenario og temporalitet. Studien vil bli utviklet i Argentina inkludert pasientbehandlingssentre med følgende inklusjons- og eksklusjonskriterier, fra 1. april/2019 (rekrutteringsfase på 12 måneder) til siste innrullerte pasient fullfører oppfølgingen på 3 år fra randomisering.

Innblanding. Test medikament(er). Både probiotika og placebo vil bli presentert i samme beholder, form og farge.

Navnet på virkestoffet Hver 50 ml flaske inneholder Lactobacillus casei 3,3 x 107 CFU / dag, Lactobacillus plantarum 3,3 x 107 CFU / dag, Streptococcus faecalis 3,3 x 107 CFU / dag og Bifidobacterium brevis 1,0 x 106 CLOFURA® dag (BIOSIDOF CLOFURA® SA, Argentina).

Administrasjonsmåte: Oral 5 ml oralt hver 12. time i 10 påfølgende dager per måned. Behandlingens varighet: 2 sykluser med kontinuerlig behandling per år i løpet av en 3-års periode (6 sykluser). Hver syklus inkluderer tre måneders behandling, etterfulgt av en pause på tre måneder.

Referanseintervensjon. Navn på virkestoffet: Placebo. Administrasjonsmåte: Oral 5 ml oralt hver 12. time i 10 påfølgende dager per måned. Behandlingens varighet: 2 sykluser med kontinuerlig behandling per år i løpet av en 3-års periode (6 sykluser). Hver syklus inkluderer tre måneders behandling, etterfulgt av en pause på tre måneder.

**På samme måte vil begge armer eksplisitt be om ikke-inntak av alkohol og inntak av en ikke-hyperkalorisk middelhavsdiett gjennom hele studien for alle pasienter.

Metodikk. Pasienter som oppfyller de nevnte inklusjons- og eksklusjonskriteriene, og som har fullført alle screeningtester, vil bli behandlet med standardtesten eller behandlingsmedisiner i henhold til retningslinjer for klinisk praksis gjennom et 1:1 randomiseringsskjema.

Randomiseringen vil være stratifisert i blokker i henhold til tidligere identifiserte prognostiske variabler og for å unngå potensielle forvirrende variabler og eller effektmodifikatorer fordelt ved en tilfeldighet på en ubalansert måte: Child Pugh score B og blodplateantall <100 000/mm3. Randomiseringen vil foregå i henhold til oppgaven ved hjelp av tall tidligere gjort av en blindet forsker og uavhengig av kliniske egenskaper og kontakt med pasientene. Alle numrene for randomiseringen vil bli lagret i lukkede ugjennomsiktige konvolutter og vil bli tildelt fortløpende i henhold til rekkefølgen for inkludering i protokollen.

*Alle hendelsene som utvikles, både primære og sekundære gjennom hele studien, vil bli evaluert av en blindet og uavhengig komité fra baselinevariabler og randomiseringsallokering. Kliniske hendelser vil bli overvåket og revurdert av denne komiteen, som vil bestå av 3 etterforskere.

Eksponeringsvariabler.

• Kliniske data

• Perifere blodprøver for måling av cytokiner, LPS og ekspresjon av TLR 4.

  • Cytokiner: Målingen av cytokiner vil bli gjort fra plasma fra perifere blodprøver. Nivåene av følgende cytokiner vil kvantifiseres i pg/ml: IL-6, TNF-α og endotoksemi eller bakteriell lipopolysakkarid (LPS). Operatørene av denne målingen vil bli blindet for enhver klinisk, mikrobiom og behandlingstildeling. Prøver som skal tas fra hver enkelt: to 10 ml rør med fullblod, ett med EDTA (natriumetylendiamintetraacetat) og et annet uten antikoagulasjonsmiddel, som skal brukes i rutinemessige laboratoriestudier og ved måling av cytokiner (IL6 og TNF alfa) og endotoksiner ( LPS). Kvantifisering av plasmacytokiner: Kommersielle reagenser av enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA) vil bli brukt for å måle nivåene av cytokiner som er tilstede i plasmaet til pasienter. Konsentrasjonene av TNF alfa og IL-6 vil bli målt med kommersielle reagenser av eBioscience, affymetrix eller en lignende kommersiell reagens tilgjengelig på markedet, strengt etter instruksjonene fra de respektive produsentene. For kvantifisering av cytokinene vil kurvene bli laget med tilsvarende konsentrasjonsstandarder.
  • Kvantifisering av endotoksiner i plasma eller serum: Måling av bakteriell LPS vil bli utført med Limulus Amebocyte Lysate Assay (LAL), Biosafe Srl kromogent endepunktsreagens eller lignende, parallelt med konsentrasjonskurven til standardene. Produsentens instruksjoner vil bli fulgt.
  • Ekspresjon av TLR 4 i mononukleære celler i perifert blod: uttrykket av TLR 4 i mononukleære celler vil kvantifiseres ved sanntids PCR-teknikk, ved bruk av spesifikke primere.

  • Avføringsprøver for tarmmikrobiom-evaluering.

    1. Metode for innsamling: En prøve av spontan fekal avføring vil bli samlet inn når som helst på dagen i en medfølgende manifold for å unngå kontakt med toalett/luktfrie materialer. Når prøven er samlet, vil den passende lokk samleren plasseres i en sikkerhetspose og i en settboks. Disse prøvene vil bli lagret frosset ved -70º. Hver avføringsprøve må være riktig merket. Senere vil prøver bli delt ut for sluttbehandling.
    2. Analyse: Fekal avføring vil bli samlet inn for å analysere tarmmikrobiomet ved hjelp av PCR-teknikken, Ilumina, ved å analysere V3-V4-regionene til 16sRNA ved bioteknologiinstituttet i Rosario (INDEAR, Rosario, Argentina). Den 16S ribosomale underenheten av rRNA vil bli analysert bakteriell, amplifisert ved hjelp av PCR-metoden (20 sykluser) og deretter en andre runde med amplifikasjon for å inkorporere multipleksadaptere (Strekkoder) (10 sykluser). I hver prosedyre vil det bli foretatt to målinger for å unngå skjevheter i amplifikasjonsinformasjon. Den massive sekvenseringen vil bli utført på et illumina MiSeq-team fra HERITAS-instituttet (CIBIC + INDEAR) i 2x300-modus for til slutt å oppnå minimum 40 000 sekvenser per individ. Kvaliteten på rådataene vil bli evaluert av FastQC, og informasjonen til parendene til Illumina vil bli kombinert med PEAR (v0.9.10). Avlesningene blir deretter filtrert etter Q30-kvalitet, og duplikatene og PCR-kimærene elimineres ved bruk av UCHIME. De filtrerte sekvensene vil bli gruppert i operasjonelle taksonomiske enheter (OTUs) med 97 % likhet med deres egen strategi implementert i QIIME (v1.91). Operatørene av denne målingen vil være blinde for de kliniske, mikrobiom og primære hendelsesvariablene.
• Følgende målinger vil bli utført hver 6. måned i hvert forsøksperson som er registrert frem til slutten av studien eller utviklingen av den primære hendelsen: vekt og høyde, samtidig medisinering, fullstendig fysisk undersøkelse, laboratorietester, Child Pugh-score, abdominal ultralyd.
• Longitudinell prøvetaking av tarmmikrobiom og cytokiner. En andre cytokinmåling vil bli gjort fra serum fra perifert blod og tarmmikrobiomprøver i fekale prøver hos alle pasienter inkludert i studien ved slutten av den første behandlingssyklusen (3. måned siden randomisering eller 12 uker) og ved slutten av studien (siste syklus) ved å bruke samme metodikk beskrevet ovenfor.

Overholdelse og oppfølging: Alle pasientene vil fortsette i protokollen til utviklingen av den primære hendelsen eller til slutten av den, etter å ha fullført en post-randomiseringsoppfølging på 3 år. Det vil bli gjennomført flere tiltak for å styrke etterlevelsen av behandling i både armer og strategier for å unngå tap av oppfølging. Overholdelse av behandlingsoverholdelse vil bli definert i 80 % av tablettene som leveres for begge armer.

Prøvestørrelsesberegning og statistisk analyse: En to-halet statistisk verdi vil bli tatt, α eller type I feil på 5 % (p verdi <0,05) og en potens eller feil type II eller β på 0,20 (potens på 80 %). Risikoen for HCC i hver arm vil bli sammenlignet ved bruk av Cox regresjonsanalyse med Hazard Ratios (HR) og 95 % konfidensintervaller, og antallet som trengs for å behandle for å forhindre et klinisk utfall vil bli beregnet, utført i henhold til intensjon-å-behandle-prinsippet . Siden den kumulative forekomsten av HCC fra tidligere data fra litteraturen er 1-6 % per år, ble en relativ risikoreduksjon av HCC-utvikling i løpet av en 3-års periode i intervensjonsarmen estimert til å være klinisk relevant med en relativ forskjell på 30 %, tilsvarende en HR på 0,7. For hver arm estimerte en prøvestørrelse på 140 forsøkspersoner, med en total populasjon på 280 pasienter, antall primære hendelser i 28.

Alle statistiske analyser vil bli utført med STATA versjon 14.0.

Analyse av mikrobiommetadata. Den bioinformatiske analysen av dataene vil bli gjort ved hjelp av en tilpasset QIIME-pipeline. For estimering av differensiell overflod mellom gruppene bruker vi DESeq2-pakken.