Probiotica bij de preventie van hepatocellulair carcinoom bij cirrose

Onderzoeksvraag Voorkomt de modulatie van het darmmicrobioom met probiotica de ontwikkeling van hepatocellulair carcinoom bij patiënten met cirrose? Het doel van deze studie is het evalueren van de werkzaamheid van probiotica bij het verminderen van de incidentie van hepatocellulair carcinoom bij patiënten met Child-Pugh AB-cirrose met portale hypertensie.

Methoden Onderzoeksopzet. Interventionele, multicenter, gerandomiseerde, dubbelblinde, placebogecontroleerde fase III-studie.

Het volgende onderzoek zal worden uitgevoerd volgens de CONSORT-richtlijnen. Scenario en tijdelijkheid. De studie zal worden ontwikkeld in Argentinië, inclusief patiëntenzorgcentra met de volgende inclusie- en exclusiecriteria, vanaf 1 april 2019 (rekruteringsfase van 12 maanden) totdat de laatste ingeschreven patiënt de follow-up van 3 jaar vanaf randomisatie voltooit.

Interventie. Drug(s) testen. Zowel probiotica als placebo worden in dezelfde verpakking, vorm en kleur gepresenteerd.

Naam van de werkzame stof Elk flesje van 50 ml bevat Lactobacillus casei 3,3 x 107 CFU/dag, Lactobacillus plantarum 3,3 x 107 CFU/dag, Streptococcus faecalis 3,3 x 107 CFU/dag en Bifidobacterium brevis 1,0 x 106 CFU/dag (BIOFLORA®, BIOSIDUS SA, Argentinië).

Wijze van toediening: Oraal 5 ml oraal om de 12 uur gedurende 10 opeenvolgende dagen per maand. Duur van de behandeling: 2 cycli van continue behandeling per jaar gedurende een periode van 3 jaar (6 cycli). Elke cyclus omvat drie maanden behandeling, gevolgd door een rustperiode van drie maanden.

Referentie interventie. Naam van de werkzame stof: Placebo. Wijze van toediening: Oraal 5 ml oraal om de 12 uur gedurende 10 opeenvolgende dagen per maand. Duur van de behandeling: 2 cycli van continue behandeling per jaar gedurende een periode van 3 jaar (6 cycli). Elke cyclus omvat drie maanden behandeling, gevolgd door een rustperiode van drie maanden.

**Evenzo zullen beide armen tijdens het onderzoek voor alle patiënten expliciet vragen om geen alcohol te consumeren en om een ​​niet-hypercalorisch mediterraan dieet te volgen.

Methodologie. Patiënten die aan de bovengenoemde in- en exclusiecriteria voldoen en alle screeningstests met succes hebben afgerond, zullen worden behandeld met de standaard test- of behandelingsmedicatie volgens de richtlijnen van de klinische praktijk door middel van een 1: 1 randomisatieschema.

De randomisatie zal gestratificeerd zijn in blokken volgens eerder geïdentificeerde prognostische variabelen en om mogelijke verstorende variabelen en/of effectmodificatoren te vermijden die op een onevenwichtige manier door toeval worden verdeeld: Child-Pugh-score B en aantal bloedplaatjes <100.000/mm3. De randomisatie zal gebeuren volgens de opdracht door middel van getallen die vooraf zijn gemaakt door een geblindeerde onderzoeker en onafhankelijk van klinische kenmerken en contact met de patiënten. Alle nummers van de randomisatie worden opgeslagen in gesloten ondoorzichtige enveloppen en worden achtereenvolgens toegewezen volgens de volgorde van opname in het protocol.

*Alle gebeurtenissen die tijdens het onderzoek zijn ontwikkeld, zowel primair als secundair, zullen worden beoordeeld door een geblindeerde en onafhankelijke commissie op basis van basislijnvariabelen en randomisatietoewijzing. Klinische gebeurtenissen zullen worden gecontroleerd en opnieuw geëvalueerd door deze commissie, die zal bestaan ​​uit 3 onderzoekers.

Blootstellingsvariabelen.

• Klinische gegevens

• Perifere bloedmonsters voor de meting van cytokines, LPS en expressie van TLR 4.

  • Cytokines: De meting van cytokines zal worden gedaan op basis van plasma van perifere bloedmonsters. De niveaus van de volgende cytokines zullen worden gekwantificeerd in pg/ml: IL-6, TNF-α en endotoxemie of bacterieel lipopolysaccharide (LPS). De operators van deze meting zullen blind zijn voor elke klinische, microbioom- en behandelingstoewijzing. Monsters die van elk individu moeten worden afgenomen: twee buisjes volbloed van 10 ml, één met EDTA (natriumethyleendiaminetetraacetaat) en één zonder antistollingsmiddel, voor gebruik in routinelaboratoriumonderzoeken en voor het meten van cytokines (IL6 en TNF-alfa) en endotoxinen ( LP). Kwantificering van plasmacytokines: Commerciële reagentia van de enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) zullen worden gebruikt om de niveaus van cytokines in de plasma's van patiënten te meten. De concentraties van TNF-alfa en IL-6 zullen worden gemeten met in de handel verkrijgbare reagentia van eBioscience, affymetrix of een vergelijkbaar in de handel verkrijgbaar reagens, strikt volgens de instructies van de respectieve fabrikanten. Voor de kwantificering van de cytokines zullen de curven gemaakt worden met de bijbehorende concentratiestandaarden.
  • Kwantificering van endotoxinen in plasma of serum: Meting van bacteriële LPS zal worden uitgevoerd door Limulus Amebocyte Lysate Assay (LAL), Biosafe Srl chromogenic endpoint reagens of vergelijkbaar, parallel aan de concentratiecurve van de standaarden. De instructies van de fabrikant worden opgevolgd.
  • Expressie van TLR 4 in mononucleaire cellen van perifeer bloed: de expressie van TLR 4 in mononucleaire cellen zal worden gekwantificeerd door middel van real-time PCR-techniek, met behulp van specifieke primers.

  • Ontlastingsmonsters voor evaluatie van het darmmicrobioom.

    1. Verzamelmethode: op elk moment van de dag wordt een monster van spontane fecale ontlasting verzameld in een bijgeleverd verdeelstuk, waarbij contact met toilet/geurloze materialen wordt vermeden. Zodra het monster is verzameld, wordt de collector met de juiste dop in een veiligheidszak en in een kitdoos geplaatst. Deze monsters worden ingevroren bewaard bij -70º. Elk fecesmonster moet correct worden geëtiketteerd. Later zullen er monsters worden verdeeld voor de uiteindelijke verwerking.
    2. Analyse: Fecale ontlasting zal worden verzameld om het darmmicrobioom te analyseren met behulp van de PCR-techniek, Ilumina, waarbij de V3-V4-regio's van 16sRNA worden geanalyseerd aan het biotechnologie-instituut van Rosario (INDEAR, Rosario, Argentinië). De 16S ribosomale subeenheid van rRNA zal bacterieel worden geanalyseerd, geamplificeerd met behulp van de PCR-methode (20 cycli) en vervolgens een tweede amplificatieronde om multiplex-adapters (streepjescodes) op te nemen (10 cycli). In elke procedure worden twee metingen uitgevoerd om vertekening van informatie over amplificatie te voorkomen. De massale sequencing zal worden uitgevoerd op een illumina MiSeq-team van het HERITAS-instituut (CIBIC + INDEAR) in 2x300-modus om uiteindelijk minimaal 40.000 sequenties per persoon te verkrijgen. De kwaliteit van de onbewerkte gegevens zal worden geëvalueerd door FastQC en de informatie van paaruiteinden van Illumina zal worden gecombineerd met behulp van PEAR (v0.9.10). De aflezingen worden vervolgens gefilterd op Q30-kwaliteit en de duplicaten en PCR-chimaera's worden geëlimineerd met behulp van UCHIME. De gefilterde sequenties zullen worden geclusterd in Operational Taxonomic Units (OTU's) met een overeenkomst van 97% met hun eigen strategie geïmplementeerd in QIIME (v1.91). De operators van deze meting zijn blind voor de variabelen klinisch, microbioom en primaire gebeurtenissen.
• De volgende metingen worden om de 6 maanden uitgevoerd bij elke ingeschreven proefpersoon tot het einde van het onderzoek of de ontwikkeling van het primaire voorval: gewicht en lengte, gelijktijdige medicatie, volledig lichamelijk onderzoek, laboratoriumtests, Child-Pugh-score, abdominale echografie.
• Longitudinale bemonstering van darmmicrobioom en cytokines. Een tweede cytokinemeting zal worden uitgevoerd op basis van serum van perifere bloed- en darmmicrobioommonsters in fecale monsters bij alle patiënten die aan het onderzoek deelnemen aan het einde van de eerste behandelingscyclus (3e maand sinds randomisatie of 12 weken) en aan het einde van het onderzoek. (laatste cyclus) volgens dezelfde methode als hierboven beschreven.

Therapietrouw en follow-up: alle patiënten gaan door met het protocol tot de ontwikkeling van het primaire voorval of tot het einde ervan, nadat ze een post-randomisatie-follow-up van 3 jaar hebben voltooid. Er zullen verschillende maatregelen worden genomen om de therapietrouw in beide armen te versterken en er zullen strategieën worden gevolgd om verlies van follow-up te voorkomen. De naleving van de therapietrouw zal worden bepaald in 80% van de tabletten die voor beide armen worden afgeleverd.

Berekening van de steekproefomvang en statistische analyse: Er wordt een tweezijdige statistische waarde genomen, α of type I-fout van 5% (p-waarde <0,05) en een power of error type II of β van 0,20 (power van 80%). Het risico op HCC in elke arm zal worden vergeleken met behulp van Cox-regressieanalyse met Hazard Ratio's (HR) en 95%-betrouwbaarheidsintervallen en het aantal dat nodig is om te behandelen om een ​​klinisch resultaat te voorkomen, wordt berekend volgens het intention-to-treat-principe . Aangezien de cumulatieve incidentie van HCC uit eerdere gegevens uit de literatuur 1-6% per jaar is, werd geschat dat een relatieve risicoreductie van HCC-ontwikkeling gedurende een periode van 3 jaar in de interventiearm klinisch relevant is met een relatief verschil van 30%, gelijk aan een HR van 0,7. Voor elke arm, een steekproefomvang van 140 proefpersonen, met een totale in te schrijven populatie van 280 patiënten, geschat aantal primaire gebeurtenissen op 28.

Alle statistische analyses worden uitgevoerd met behulp van STATA versie 14.0.

Analyse van metadata van het microbioom. De bio-informatica-analyse van de gegevens zal worden uitgevoerd met behulp van een op maat gemaakte QIIME-pijplijn. Voor de schatting van differentiële abundantie tussen de groepen gebruiken we het DESeq2-pakket.