Probióticos en la prevención del carcinoma hepatocelular en la cirrosis

Pregunta de investigación ¿La modulación del microbioma intestinal con probióticos previene el desarrollo de carcinoma hepatocelular en pacientes con cirrosis? El objetivo de este estudio es evaluar la eficacia de los probióticos en la reducción de la incidencia de carcinoma hepatocelular en pacientes con cirrosis Child Pugh A-B con hipertensión portal.

Métodos Diseño del estudio. Ensayo de intervención de fase III, multicéntrico, aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo.

El siguiente estudio se llevará a cabo siguiendo las directrices de CONSORT. Escenario y temporalidad. El estudio se desarrollará en Argentina incluyendo centros de atención de pacientes con los siguientes criterios de inclusión y exclusión, desde el 1 de abril de 2019 (fase de reclutamiento de 12 meses) hasta que el último paciente inscrito complete el seguimiento de 3 años desde la aleatorización.

Intervención. Fármaco(s) de prueba. Tanto el probiótico como el placebo se presentarán en el mismo envase, forma y color.

Nombre del principio activo Cada frasco de 50 ml contiene Lactobacillus casei 3,3 x 107 CFU/día, Lactobacillus plantarum 3,3 x 107 CFU/día, Streptococcus faecalis 3,3 x 107 CFU/día y Bifidobacterium brevis 1,0 x 106 CFU/día (BIOFLORA®, BIOSIDUS SA, Argentina).

Vía de administración: Oral 5 ml por vía oral cada 12 horas durante 10 días consecutivos al mes. Duración del tratamiento: 2 ciclos de tratamiento continuo al año durante un periodo de 3 años (6 ciclos). Cada ciclo incluye tres meses de tratamiento, seguido de un período de descanso de tres meses.

Intervención de referencia. Nombre del principio activo: Placebo. Vía de administración: Oral 5 ml por vía oral cada 12 horas durante 10 días consecutivos al mes. Duración del tratamiento: 2 ciclos de tratamiento continuo al año durante un periodo de 3 años (6 ciclos). Cada ciclo incluye tres meses de tratamiento, seguido de un período de descanso de tres meses.

**Asimismo, ambos brazos solicitarán explícitamente el no consumo de alcohol y el consumo de dieta mediterránea no hipercalórica durante todo el estudio para todos los pacientes.

Metodología. Los pacientes que cumplan los criterios de inclusión y exclusión antes mencionados, y hayan superado con éxito todas las pruebas de cribado, serán tratados con la prueba estándar o medicación de tratamiento según las guías de práctica clínica mediante un esquema de aleatorización 1:1.

La aleatorización se hará en bloques estratificados según variables pronósticas previamente identificadas y con el fin de evitar posibles variables de confusión y/o modificadores de efecto distribuidos al azar de forma desequilibrada: Child Pugh score B y plaquetas <100.000/mm3. La aleatorización se realizará de acuerdo a la asignación mediante números realizados previamente por un investigador ciego e independiente de las características clínicas y contacto con los pacientes. Todos los números de la aleatorización se almacenarán en sobres opacos cerrados y se asignarán consecutivamente según el orden de inclusión en el protocolo.

*Todos los eventos desarrollados, tanto primarios como secundarios a lo largo del estudio, serán evaluados por un comité ciego e independiente a partir de variables basales y asignación de aleatorización. Los eventos clínicos serán monitoreados y reevaluados por este comité, que estará compuesto por 3 investigadores.

Variables de exposición.

• Datos clinicos

• Muestras de sangre periférica para la medida de citocinas, LPS y expresión de TLR 4.

  • Citoquinas: La medición de citoquinas se realizará a partir de plasma de muestras de sangre periférica. Se cuantificarán los niveles de las siguientes citocinas en pg/ml: IL-6, TNF-α y endotoxemia o lipopolisacárido bacteriano (LPS). Los operadores de esta medición estarán cegados a cualquier asignación clínica, de microbioma y de tratamiento. Muestras a obtener de cada individuo: dos tubos de 10ml de sangre entera, uno con EDTA (etilendiaminotetraacetato de sodio) y otro sin anticoagulante, para ser utilizados en estudios de laboratorio de rutina y en la medición de citocinas (IL6 y TNF alfa) y endotoxinas ( LPS). Cuantificación de citocinas plasmáticas: Se utilizarán reactivos comerciales de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para medir los niveles de citocinas presentes en los plasmas de los pacientes. Las concentraciones de TNF alfa e IL-6 se medirán con reactivos comerciales de eBioscience, affymetrix o reactivo comercial similar disponible en el mercado, siguiendo estrictamente las instrucciones de los respectivos fabricantes. Para la cuantificación de las citocinas se realizarán las curvas con los patrones de concentración correspondientes.
  • Cuantificación de endotoxinas en plasma o suero: La medición de LPS bacteriano se realizará mediante Limulus Amebocyte Lysate Assay (LAL), reactivo cromogénico de punto final Biosafe Srl o similar, en paralelo con la curva de concentración de los estándares. Se seguirán las instrucciones del fabricante.
  • Expresión de TLR 4 en células mononucleares de sangre periférica: la expresión de TLR 4 en células mononucleares se cuantificará mediante la técnica de PCR en tiempo real, utilizando cebadores específicos.

  • Muestras de heces para la evaluación del microbioma intestinal.

    1. Método de recolección: Se recolectará una muestra de heces fecales espontáneas en cualquier momento del día en un colector suministrado, evitando el contacto con el inodoro/materiales inodoros. Una vez recolectada la muestra, el colector debidamente tapado se colocará dentro de una bolsa de seguridad y dentro de una caja de kit. Estas muestras se conservarán congeladas a -70º. Cada muestra fecal debe estar debidamente etiquetada. Más tarde, las muestras se dividirán en alícuotas para el procesamiento final.
    2. Análisis: Se recolectarán heces fecales para analizar el microbioma intestinal mediante la técnica PCR, Ilumina, analizando las regiones V3-V4 del 16sRNA en el Instituto de Biotecnología de Rosario (INDEAR, Rosario, Argentina). Se analizará la subunidad ribosomal 16S del ARNr bacteriano, amplificando mediante el método PCR (20 ciclos) y luego una segunda ronda de amplificación para incorporar adaptadores multiplex (códigos de barras) (10 ciclos). En cada procedimiento se realizarán dos mediciones para evitar sesgos de información de amplificación. La secuenciación masiva se realizará en un equipo illumina MiSeq del instituto HERITAS (CIBIC + INDEAR) en modo 2x300 para obtener finalmente un mínimo de 40.000 secuencias por individuo. FastQC evaluará la calidad de los datos sin procesar y la información de los extremos de los pares de Illumina se combinará mediante PEAR (v0.9.10). Posteriormente se filtran las lecturas por calidad Q30 y se eliminan los duplicados y quimeras PCR mediante UCHIME. Las secuencias filtradas se agruparán en unidades taxonómicas operativas (OTU) con un 97 % de similitud con su propia estrategia implementada en QIIME (v1.91). Los operadores de esta medición estarán ciegos a las variables clínicas, de microbioma y de eventos primarios.
• Se realizarán las siguientes mediciones cada 6 meses en cada sujeto inscripto hasta el final del estudio o desarrollo del evento primario: peso y talla, medicación concomitante, examen físico completo, exámenes de laboratorio, Child Pugh score, ecografía abdominal.
• Muestreo longitudinal de microbioma intestinal y citocinas. Se realizará una segunda medición de citoquinas en suero de sangre periférica y muestras de microbioma intestinal en muestras fecales de todos los pacientes incluidos en el estudio al final del primer ciclo de tratamiento (3.er mes desde la aleatorización o 12 semanas) y al final del estudio. (último ciclo) utilizando la misma metodología descrita anteriormente.

Adherencia y Seguimiento: Todos los pacientes continuarán en el protocolo hasta el desarrollo del evento primario o hasta el final del mismo, habiendo completado un seguimiento post-aleatorización de 3 años. Se llevarán a cabo diversas medidas para reforzar la adherencia al tratamiento en ambos brazos y estrategias para evitar pérdidas de seguimiento. La adherencia al cumplimiento del tratamiento se definirá en el 80% de los comprimidos entregados para ambos brazos.

Cálculo del tamaño de la muestra y análisis estadístico: Se tomará un valor estadístico de dos colas, α o error tipo I del 5% (valor p <0,05) y una potencia o error tipo II o β de 0,20 (potencia del 80%). El riesgo de CHC en cada brazo se comparará mediante el análisis de regresión de Cox con cocientes de riesgos instantáneos (HR) e intervalos de confianza del 95 %, y se calculará el número necesario a tratar para prevenir un resultado clínico, según el principio de intención de tratar. . Dado que la incidencia acumulada de CHC a partir de datos previos de la literatura es de 1-6 % por año, se estimó que la reducción del riesgo relativo de desarrollo de CHC durante un período de 3 años en el brazo de intervención era clínicamente relevante con una diferencia relativa del 30 %. equivalente a un HR de 0,7. Para cada brazo, un tamaño de muestra de 140 sujetos, con una población total a enrolar de 280 pacientes, número estimado de eventos primarios en 28.

Todos los análisis estadísticos se realizarán utilizando STATA versión 14.0.

Análisis de metadatos del microbioma. El análisis bioinformático de los datos se realizará mediante un pipeline QIIME personalizado. Para la estimación de la abundancia diferencial entre los grupos utilizamos el paquete DESeq2.