Probióticos na Prevenção do Carcinoma Hepatocelular na Cirrose

Questão de pesquisa A modulação do microbioma intestinal com probióticos previne o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular em pacientes com cirrose? O objetivo deste estudo é avaliar a eficácia dos probióticos na redução da incidência de carcinoma hepatocelular em pacientes com cirrose Child Pugh A-B com hipertensão portal.

Métodos Desenho do estudo. Fase III intervencional, multicêntrico, randomizado, duplo-cego, controlado por placebo.

O estudo a seguir será realizado seguindo as diretrizes do CONSORT. Cenário e temporalidade. O estudo será desenvolvido na Argentina, incluindo centros de atendimento ao paciente com os seguintes critérios de inclusão e exclusão, a partir de 1º de abril de 2019 (fase de recrutamento de 12 meses) até que o último paciente inscrito complete o acompanhamento de 3 anos a partir da randomização.

Intervenção. Droga(s) de teste. Tanto o probiótico quanto o placebo serão apresentados no mesmo recipiente, forma e cor.

Nome da substância ativa Cada frasco de 50 ml contém Lactobacillus casei 3,3 x 107 UFC/dia, Lactobacillus plantarum 3,3 x 107 UFC/dia, Streptococcus faecalis 3,3 x 107 UFC/dia e Bifidobacterium brevis 1,0 x 106 UFC/dia (BIOFLORA®, BIOSIDUS SA, Argentina).

Via de administração: Via oral 5 ml por via oral a cada 12 horas por 10 dias consecutivos por mês. Duração do tratamento: 2 ciclos de tratamento contínuo por ano durante um período de 3 anos (6 ciclos). Cada ciclo inclui três meses de tratamento, seguidos de um período de descanso de três meses.

Intervenção de referência. Nome da substância ativa: Placebo. Via de administração: Via oral 5 ml por via oral a cada 12 horas por 10 dias consecutivos por mês. Duração do tratamento: 2 ciclos de tratamento contínuo por ano durante um período de 3 anos (6 ciclos). Cada ciclo inclui três meses de tratamento, seguidos de um período de descanso de três meses.

**Da mesma forma, ambos os braços solicitarão explicitamente o não consumo de álcool e o consumo de uma dieta mediterrânea não hipercalórica ao longo do estudo para todos os pacientes.

Metodologia. Os pacientes que atenderem aos critérios de inclusão e exclusão acima mencionados e tiverem concluído com sucesso todos os testes de triagem serão tratados com o teste padrão ou medicação de tratamento de acordo com as diretrizes de prática clínica por meio de um esquema de randomização 1:1.

A randomização será estratificada em blocos de acordo com variáveis ​​prognósticas previamente identificadas e para evitar potenciais variáveis ​​de confusão e ou modificadores de efeito distribuídos ao acaso de forma desbalanceada: Child Pugh score B e contagem de plaquetas <100.000/mm3. A randomização será realizada de acordo com a atribuição por meio de números previamente feitos por um pesquisador cego e independente das características clínicas e contato com os pacientes. Todos os números da randomização serão armazenados em envelopes opacos fechados e serão atribuídos consecutivamente de acordo com a ordem de inclusão no protocolo.

*Todos os eventos desenvolvidos, primários e secundários ao longo do estudo, serão avaliados por um comitê cego e independente a partir das variáveis ​​basais e alocação aleatória. Os eventos clínicos serão monitorados e reavaliados por este comitê, que será composto por 3 investigadores.

Variáveis ​​de exposição.

• Dados clínicos

• Amostras de sangue periférico para dosagem de citocinas, LPS e expressão de TLR 4.

  • Citocinas: A dosagem de citocinas será feita a partir de plasma de amostras de sangue periférico. Serão quantificados os níveis das seguintes citocinas em pg/ml: IL-6, TNF-α e endotoxemia ou lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano. Os operadores desta medição serão cegos para qualquer alocação clínica, microbioma e tratamento. Amostras a serem obtidas de cada indivíduo: dois tubos de 10ml de sangue total, um com EDTA (tetraacetato de etilenodiamina de sódio) e outro sem anticoagulante, para uso em estudos laboratoriais de rotina e na dosagem de citocinas (IL6 e TNF alfa) e endotoxinas ( LPS). Quantificação de citocinas plasmáticas: Reagentes comerciais de ensaio imunoenzimático (ELISA) serão utilizados para medir os níveis de citocinas presentes nos plasmas dos pacientes. As concentrações de TNF alfa e IL-6 serão medidas com reagentes comerciais da eBioscience, affymetrix, ou um reagente comercial similar disponível no mercado, seguindo rigorosamente as instruções dos respectivos fabricantes. Para a quantificação das citocinas, as curvas serão feitas com os padrões de concentração correspondentes.
  • Quantificação de endotoxinas em plasma ou soro: A dosagem de LPS bacteriano será realizada por Limulus Amebocyte Lysate Assay (LAL), reagente de ponto final cromogênico Biosafe Srl ou similar, em paralelo com a curva de concentração dos padrões. As instruções do fabricante serão seguidas.
  • Expressão de TLR 4 em células mononucleares de sangue periférico: a expressão de TLR 4 em células mononucleares será quantificada pela técnica de PCR em tempo real, utilizando primers específicos.

  • Amostras de fezes para avaliação do microbioma intestinal.

    1. Método de Coleta: Uma amostra de fezes espontâneas será coletada a qualquer hora do dia em coletor fornecido evitando contato com materiais de lavatório/inodoros. Uma vez coletada a amostra, o coletor devidamente tampado será colocado dentro de um saco de segurança e dentro de uma caixa kit. Estas amostras serão armazenadas congeladas a -70º. Cada amostra fecal deve ser devidamente rotulada. Posteriormente, as amostras serão aliquotadas para processamento final.
    2. Análise: As fezes fecais serão coletadas para analisar o microbioma intestinal usando a técnica de PCR, Ilumina, analisando as regiões V3-V4 do 16sRNA no Instituto de biotecnologia de Rosario (INDEAR, Rosario, Argentina). A subunidade ribossômica 16S do rRNA será analisada bacteriana, amplificando pelo método de PCR (20 ciclos) e em seguida uma segunda rodada de amplificação para incorporar adaptadores multiplex (códigos de barras) (10 ciclos). Em cada procedimento, serão feitas duas medições para evitar vieses de informação de amplificação. O sequenciamento maciço será realizado em uma equipe illumina MiSeq do instituto HERITAS (CIBIC + INDEAR) no modo 2x300 para finalmente obter um mínimo de 40.000 sequências por indivíduo. A qualidade dos dados brutos será avaliada pelo FastQC e as informações dos pair-ends do Illumina serão combinadas usando PEAR (v0.9.10). As leituras são então filtradas pela qualidade Q30 e as duplicatas e quimeras de PCR são eliminadas usando UCHIME. As sequências filtradas serão agrupadas em Unidades Taxonômicas Operacionais (OTUs) com 97% de similaridade com sua própria estratégia implementada no QIIME (v1.91). Os operadores desta medição serão cegos para as variáveis ​​clínicas, do microbioma e do evento primário.
• As seguintes medições serão realizadas a cada 6 meses em cada sujeito inscrito até o final do estudo ou desenvolvimento do evento primário: peso e altura, medicação concomitante, exame físico completo, exames laboratoriais, escore de Child Pugh, ultrassonografia abdominal.
• Amostragem longitudinal do microbioma intestinal e citocinas. Uma segunda medição de citocinas será feita a partir do soro de sangue periférico e amostras de microbioma intestinal em amostras fecais em todos os pacientes incluídos no estudo no final do primeiro ciclo de tratamento (3º mês desde a randomização ou 12 semanas) e no final do estudo (último ciclo) usando a mesma metodologia descrita acima.

Adesão e Acompanhamento: Todos os pacientes continuarão no protocolo até o desenvolvimento do evento primário ou até o término do mesmo, tendo completado um seguimento pós-randomização de 3 anos. Várias medidas serão realizadas para reforçar a adesão ao tratamento em ambos os braços e estratégias para evitar a perda de seguimento. A adesão ao tratamento será definida em 80% dos comprimidos entregues para ambos os braços.

Cálculo do tamanho da amostra e análise estatística: Será considerado um valor estatístico bicaudal, α ou erro tipo I de 5% (p valor <0,05) e um poder ou erro tipo II ou β de 0,20 (poder de 80%). O risco de CHC em cada braço será comparado usando análise de regressão de Cox com Hazard Ratios (HR) e intervalos de confiança de 95% e o número necessário para tratar para prevenir um desfecho clínico será calculado, feito de acordo com o princípio de intenção de tratar . Uma vez que a incidência cumulativa de CHC de dados anteriores da literatura é de 1-6% ao ano, uma redução relativa do risco de desenvolvimento de CHC durante um período de 3 anos no braço de intervenção foi considerada clinicamente relevante com uma diferença relativa de 30%, equivalente a uma HR de 0,7. Para cada braço, um tamanho de amostra de 140 indivíduos, com uma população total de 280 pacientes, número estimado de eventos primários em 28.

Todas as análises estatísticas serão realizadas no STATA versão 14.0.

Análise de metadados do microbioma. A análise bioinformática dos dados será feita usando um pipeline personalizado do QIIME. Para a estimativa da abundância diferencial entre os grupos utilizamos o pacote DESeq2.